子囊菌类有毒蘑菇所属类群DNA条形码的筛选及快速检测技术研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dongmeizi1988
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蘑菇中毒已成为我国亟需解决的食品安全问题之一。在针对毒蘑菇的研究中,国内外研究学者专注于大型担子菌的较多,大型子囊菌的较少。因此,本研究基于DNA条形码、DNA微条形码、分子身份证和环介导等温扩增技术对子囊菌类有毒蘑菇及其所属类群展开了物种鉴定技术研究。在DNA条形码方面,我们通过评估属内PCR扩增与测序成功率、种内和种间遗传差异、物种分辨能力水平对马鞍菌属、盘菌属和鹿花菌属进行了DNA条形码的筛选,最终建议马鞍菌属优选核心条形码为ITS+LSU,辅助条形码为ITS和LSU;盘菌属优选核心条形码为rpb2,辅助条形码为ITS和SSU;鹿花菌属优选核心条形码为ITS+SSU,辅助条形码ITS和SSU。为了解决DNA降解无法扩增全长标准条形码的问题,基于ITS序列片段本研究设计出针对于鹿花菌属的DNA Mini-barcode特异性引物,并进行了通用性验证、适用性和物种分辨率分析,结果表明:本研究所设计的鹿花菌属DNA Mini-barcode引物通用性和适用性强,对DNA降解严重的鹿花菌属样品可以准确鉴定,解决了因蒸煮或消化等处理后DNA严重降解的样品无法基于传统形态学或DNA标准条形码进行准确鉴定的问题。此外,本研究挖掘出赭鹿花菌和泡质盘菌的“分子身份证”,序列长度分别为:31bp和32bp,并基于分子身份证进行了物种快速检测技术探索,设计了特异性引物,并进行了引物特异性验证、适用性和灵敏度分析,结果表明:本研究所设计的赭鹿花菌和泡质盘菌分子身份证具有物种唯一性,其引物具有较强的特异性,且相对于ITS通用引物进行PCR扩增具有较高的适用性,特别是针对DNA降解严重的赭鹿花菌和泡质盘菌样品可以有效检测,灵敏度检出浓度低至1fg/μl,基于此开发设计出检测试剂盒方便现场快速检测。此外,基于环介导等温扩增技术进行了赭鹿花菌和弹性马鞍菌的快速鉴定研究。根据种间分化和种内保守区间我们设计出了赭鹿花菌和弹性马鞍菌的LAMP引物组,并进行了引物特异性验证、灵敏度和实用性分析,结果表明:赭鹿花菌LAMP引物组能够在90分钟内完成对赭鹿花菌的特异性鉴定,灵敏度高,检出限达到1ng;弹性马鞍菌LAMP引物组能够在60分钟内完成对弹性马鞍菌的特异性鉴定,灵敏度高,检出限达1pg,采用比色法可以肉眼直观的看到反应结果,这为毒蘑菇物种鉴定提供了一种准确、快速和低成本的检测方法,适用于现场快速检测。
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