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研究背景：慢性氟中毒时成骨细胞怎样被激活、骨转换怎样被加速，是地方性氟中毒发病机制中亟待解决的关键问题。以往研究中发现，染氟成骨细胞中与内质网应激相关的蛋白BiP、蛋白质二硫键异构酶、蛋白酶体26SATP酶和硫氧还蛋白表达增多。本实验拟体外培养成骨细胞染氟并结合整体氟中毒动物实验，观察内质网应激引发的关键因子PERK及其下游ATF4和Nrf2等基因和蛋白水平的表达变化，分析其与成骨细胞增生、分化和骨形成间的相互关系，探讨内质网应激及PERK信号通路在氟作用下成骨细胞激活、骨转换加速中的作用；检测与成骨细胞增殖、分化等相关的调控因子的变化，阐明内质网应激通过哪些因素介导氟中毒骨病变的发生、发展。本实验的完成有助于发现以往氟骨症机制研究从未涉及的新的因子和信号通路的重要作用，为氟骨症防治策略提供新的思路和理论依据。实验方法：动物实验：100只Wistar大鼠，按体重均匀分成对照组、低氟组和高氟组3组。大鼠通过灌胃给氟（双蒸水配置NaF,浓度为2.21g/L，相当于100mgF-/ml），低氟组大鼠按照每天10mg F-/kg体重给氟，高氟组大鼠每天20mg F-/kg体重给氟，对照组通过灌胃给以双蒸水。大鼠投氟1、2和3月后分别经乙醚麻醉，采血、分离血清以备生化检测。实验结束后取一侧胫骨采用Hologic Discovery WA骨密度仪检测大鼠整只胫骨骨密度变化。同时，取一侧大鼠股骨经10%EDTA脱钙，常规脱水、石蜡包埋、制作病理切片，HE染色和免疫组化；取另一侧股骨提取总RNA进行相关基因的表达分析。小鼠成骨细胞系MC3T3-E1体外实验：MC3T3-E1细胞植入96孔板，时间分别为1、3、7和14天，每个时间段分为对照组和0.1、1.0、2.0、4.0、8.0、16、20、32和64mg F-/L组9个不同氟浓度组，采用CCK-8检测细胞增殖活性。根据细胞活性的变化趋势，选取具有代表性低、中、高剂量氟作用成骨细胞。将细胞植入24孔培养板，分为对照组及2.0、8.0和20mg F-/L3个不同氟浓度组，进行成骨细胞早期分化标志ALP和后期分化成熟标志矿化结节特异性染色。免疫荧光实验检测不同染氟条件下成骨细胞BiP蛋白表达的变化。采用Thermo公司ON-TARGETplus siRNA进行BiP基因和PERK基因干扰实验，提取细胞RNA进行实时PCR定量，分析基因干扰前后成骨和内质网应激相关基因的表达变化。实验结果：动物实验结果：1.灌胃方式给氟，保证大鼠每日摄氟量的精确性，准确复制出骨吸收增强到骨形成加速的不同病变特征的氟中毒大鼠骨病变。2.通过氟中毒大鼠骨病理形态、骨密度和骨组织成骨、破骨相关的基因考察结果，证明氟中毒大鼠氟骨症呈特征性的骨吸收活跃到成骨活跃的骨转换加强病变特征。3.大鼠投氟早期引起内质网应激并激发未折叠蛋白反应关键因子PERK、ATF6和IRE1，PERK信号因子的变化与氟中毒骨吸收增强具有一致性，下游因子Nrf2的变化与成骨因子变化相一致。MC3T3-E1体外实验结果：1.氟对成骨细胞具有双向效应，即低剂量氟刺激细胞活性，而高剂量氟抑制细胞活性。2.染氟成骨细胞内成骨相关基因的表达变化呈双向性，即低氟条件下升高，但在高氟条件下降低。3.染氟明显刺激成骨细胞UPR信号通路的表达，BiP和PERK表达下调抑制UPR通路，且成骨相关转录因子表达明显减少。实验结论：1、本实验采用灌胃给氟的方式，复制了骨转换加速表征的氟骨症动物模型，主要体现在投氟早期以骨吸收为主，后期成骨为主要特征的病理变化。2、投氟激发大鼠内质网应激,诱导大鼠骨骼中未折叠蛋白反应的PERK、ATF6和IRE1表达，其中PERK增高与破骨关键转录因子相一致,Nrf2与成骨关键转录因子表达变化相一致，提示PERK及Nrf2与氟骨症的骨转换加速有一定关联。3、染氟成骨细胞体外实验进一步明确了PERK及其下游因子Nrf2在氟刺激成骨和破骨方面扮演重要角色，证明了内质网应激及其PERK信号通路在氟骨症发病机制中具有重要作用。