论文部分内容阅读
大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)起源于中国，是地球上最重要的作物之一。大豆不仅占据了世界油料作物市场很大部分，也是人类食物和动物饲料中蛋白质的主要来源。随着社会经济的发展和生活水平的不断提高，人们不但对大豆的需求量越来越大，对大豆的品质也提出了更高的要求。目前，在进口转基因大豆的竞争下，我国大豆生产下降已经成为不争的事实，这种状况势必影响我国的大豆种子产业。因此，我国在大豆研发和生产战略上，迫切需要对大豆基因功能研究技术和育种方法进行改良与创新。 本研究的目的是以我国主要栽培的大豆品种为研究材料，利用CRISPR/Cas9系统对大豆油脂合成与代谢相关基因进行精确编辑，建立大豆基因功能研究新技术和育种新方法。 我们首先构建了pRGEB31和pCAMBIA3301-Cas9两种载体，并在发根农杆菌K599介导的大豆子叶转化体系中验证了CRISPR/Cas9系统在大豆当中的编辑活性。结果显示，pRGEB31和pCAMBIA3301-Cas9载体均成功表达了sgRNA以及Cas9蛋白，并对目标基因进行了编辑，pRGEB31载体的突变率为16.7％，pCAMBIA3301-Cas9载体突变率为20％。 我们还尝试利用根癌农杆菌转化大豆下胚轴，检测了CRISPR/Cas9系统在其中的基因编辑情况。结果显示，使用pCAMBIA3301-Cas9载体转化得到的愈伤组织中CRISPR/Cas9系统成功的引入Indels;然而在pRGEB31载体转化得到的愈伤组织中并未检测到Indels的发生。导致这些不同结果的原因可能与启动子、基因差异、受体细胞类型等有关。 我们还检测了使用一条定制的sgRNA同时靶定多个内源基因并对其进行编辑的可行性。本实验设计的FAD2-2BC可同时对GmFAD2-2B与GmFAD2-2C的外显子区域进行编辑，得到的两个产生编辑的愈伤组织中，其中一个产生了两种类型的Indels。 大豆的品质改良是大豆育种的重要目标之一，通过利用CRISPR/Cas9系统对相关基因进行编辑，最终得到改良品种对我国大豆产业具有重要意义。