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哺乳动物卵母细胞体外培养时,由于离开了在体卵泡环境,使卵母细胞内的环腺苷磷酸(cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate,c AMP)水平迅速下降,从而导致卵母细胞内成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)活性恢复,过早启动减数分裂。减数分裂的过早启动和完成,使卵母细胞没有足够的时间完成胞质成熟所需要的物质储备,因而胞质成熟不充分,并导致体外培养的卵母细胞核成熟(减数分裂)和胞质成熟不同步,获得的卵母细胞的质量低、后续发育能力差。线粒体作为卵母细胞能量产生的主要中心,通过一系列氧化磷酸化过程为卵母细胞的成熟及其后续发育提供能量。同时,线粒体与卵母细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和消除密切相关,因此在调控卵母细胞氧化应激中发挥重要作用。已有研究证明,C型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)可通过作用于卵丘细胞鸟苷酸环化酶受体(natriuretic peptide receptor 2,NPR2)维持卵母细胞减数分裂阻滞,从而为胞质成熟赢得了更多的时间,使卵母细胞胞质能够充分成熟,从而提高卵母细胞质量。其中,CNP是否通过调节卵母细胞中的线粒体功能,进而影响到卵母细胞质量,及其调节的机制需要进一步解析。本研究主要探讨CNP对小鼠卵母细胞中线粒体形态、分布、氧化代谢的影响及其对线粒体融合、分裂和氧化代谢相关基因表达的影响,探讨CNP对小鼠卵母细胞线粒体生理状态的影响及其调控机制。研究内容和研究结果如下:(1)选择发情前期小鼠,腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)促进卵泡发育,PMSG处理24 h后处死小鼠、采集卵巢,分离小鼠卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)进行COCs体外培养。在培养的1 h,2 h,3 h和4 h时,回收培养的COCs进行GVBD检测,结果发现小鼠COCs在基础培养液培养2 h前后卵母细胞迅速发生生发泡破裂(germinal vesicle break down,GVBD),GVBD发生率为53.42±10.53%,到4 h时GVBD发生率达到85.86±3.80%,所以选择培养2 h作为后续卵母细胞线粒体氧化代谢、数量分布等研究工作的检测时间点。(2)为了检测CNP对小鼠卵母细胞体外培养过程中线粒体氧化代谢的影响,将COCs分为两组,即对照组(基础培养液组)和根据实验室前期研究结果设计的CNP处理组(添加50 n M CNP的培养液组)中培养2 h。培养结束后,脱去卵丘细胞,利用相关荧光探针、试剂盒检测卵母细胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量和线粒体膜电位水平。结果表明,CNP处理组卵母细胞中的ROS含量显著低于对照组(P<0.05),GSH含量和线粒体膜电位水平显著高于对照组(P<0.05)。说明经CNP处理降低了小鼠卵母细胞ROS水平,提升了抗氧化应激能力(谷胱甘肽水平升高)和线粒体活性(膜电位水平升高)。(3)为了检测CNP对小鼠卵母细胞体外培养过程中线粒体分布和数量的影响,对卵母细胞的线粒体和核进行染色,以确定卵母细胞中线粒体形态和分布;提取两组的小鼠卵母细胞中的线粒体DNA,采用q RT-PCR技术检测卵母细胞线粒体拷贝数。结果表明,CNP处理2 h后,小鼠卵母细胞线粒体呈核周分布,同时在核周有小的簇状聚集,而对照组卵母细胞中的线粒体颗粒小,并均匀分布于胞质中;CNP处理组卵母细胞中的线粒体拷贝数显著高于对照组(P<0.05)。可以看出,CNP处理的小鼠卵母细胞中的线粒体分布更为合理,这种形态分布更有利于发挥线粒体功能;相较于对照组,线粒体DNA的拷贝数也更高,即线粒体数量更多。线粒体的合理分布和拷贝数的增加,可能为卵母细胞的胞质成熟及后续发育能力的提高提供了更加充足的能量供应和更加合理的能量分配。(4)为进一步研究CNP提高卵母细胞线粒体活性的机制。应用q RT-PCR技术和Western Blot技术检测卵母细胞的线粒体融合、分裂和代谢相关基因表达情况。结果显示,与对照组相比,CNP处理组中线粒体分裂相关基因FIS1和DRP1的m RNA表达水平显著上升(P<0.05),线粒体融合相关基因OPA1和MFN1/2的m RNA表达水平显著上升(P<0.05),线粒体代谢相关基因SIRT1、PGC-1α、TFAM、NRF1/2的m RNA表达显著上升(P<0.05)。同时,CNP处理组卵母细胞线粒体活性关键调控因子PGC-1α蛋白表达水平显著上升(P<0.05),PGC-1α上游调控因子CREB的磷酸化水平显著上升(P<0.05);进一步采用CNP与CREB的上游调控分子PKA(protein kinase A,PKA)抑制剂H89共同处理小鼠卵母细胞,结果卵母细胞中PGC-1α蛋白表达水平和CREB磷酸化水平显著下降(P<0.05),但是与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。说明CNP处理促进了CREB的磷酸化,从而增加了PGC-1α蛋白的表达水平。这些结果表明,CNP通过激活PKA继而磷酸化CREB,促进了线粒体相关基因和蛋白的表达,最终提高卵母细胞线粒体活性。综上所述,CNP通过PKA-CREB通路促进了小鼠卵母细胞线粒体相关基因的表达,促进了PGC-1α蛋白的表达,提高了小鼠卵母细胞中线粒体的活性和代谢功能。