研究背景及目的鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)是存在于血液中的一种天然生物活性鞘磷脂,与其它生物活性脂类如溶血性磷脂酸(LPA),1-磷酸鞘氨醇(S1P)类似,SPC除了作为生物膜上的结构组分以外,还可以作为信号分子调节细胞分化,增殖和凋亡等过程。另外,SPC参与了多种疾病的发生发展过程,包括癌症,心血管疾病,尼曼-匹克疾病,过敏性皮肤炎,脑血管痉挛等。因此,作为一种能够调节疾病的生物活性鞘磷脂类衍生物,SPC具有广阔的研究前景。心肌梗塞(Myocardial Infarction, MI)是引发发展中国家中老年人死亡的重要原因之一。心脏血液供应中断导致心肌无法得到充足的氧气和养料,引发心肌细胞凋亡是缺血性心肌损伤的主要机制。心肌细胞是终末分化的细胞,其分裂增殖能力极低,因此缺血导致的心肌细胞损失往往对心脏造成不可逆的损伤。自噬是细胞中存在的一种非常保守的过程,能够清除细胞内的长寿命蛋白和损伤的细胞器,维持细胞内环境的稳态。细胞内外的各种刺激都能够引起细胞的自噬,而越来越多的研究也表明自噬在细胞命运的决定中发挥着重要的作用。适度自噬可以抑制细胞凋亡,促进存活；过度的自噬则可以引起细胞的死亡,被称为自噬性死亡。而关于细胞自噬和细胞死亡之间的关系及调节机制仍然需要进一步的研究。针对以上科学问题,本论文研究了SPC在心肌细胞中的作用,探究了SPC诱导的自噬与心肌细胞凋亡的关系,并且进一步研究了SPC调节自噬的分子机制。我们的研究为阐明细胞凋亡和自噬的关系,了解生物活性脂类SPC对自噬信号的调节机制提供了新的实验证据,为诊断和治疗缺血性心脏疾病提供了新的生物指标和潜在的作用靶点。我们的前期研究发现SPC能够广泛促进血管内皮细胞和心肌细胞的自噬,我们推测SPC在诱导细胞自噬方面具有广谱性。许多研究表明自噬在癌症的发生发展和治疗过程中具有复杂的影响。作为一种细胞防御机制,自噬能够通过促进代谢前体的循环利用,抑制炎症等过程促进肿瘤细胞的存活,引起化疗过程中肿瘤细胞的抗药性。另一方面,许多药物能够通过引起细胞的自噬性死亡来达到杀死癌细胞的目的。然而,目前关于自噬在肺癌及其治疗中的作用的研究较少。因此我们就SPC对非小细胞肺癌细胞自噬及存活的作用进行了深入研究。我们的研究不仅验证了SPC对自噬诱导的普遍性,同时也为非小细胞肺癌的诊断和治疗的提供了生物检测指标和治疗靶点。研究结果1.SPC通过脂筏PTEN/Akt1/mTOR介导的自噬抑制心肌细胞凋亡1.1 SPC抑制心肌细胞凋亡我们利用缺氧诱导原代大鼠乳鼠心肌细胞(NRCM)凋亡,利用去血清诱导H9c2心肌细胞凋亡,并且检测了SPC对该过程的影响。Hoechst 33258染色显示SPC抑制NRCM和H9c2细胞核凝集和片段化。ANXA5-PE/PI细胞染色及流式细胞检测显示,SPC能够抑制缺氧诱导的NRCM凋亡；western blot结果显示,SPC抑制H9c2细胞中凋亡蛋白Caspase 3和PARP1的切割。另外,SPC逆转了去血清引起的H9c2细胞内ROS水平的升高。因此,SPC可以抑制心肌细胞的凋亡。1.2 SPC诱导心肌细胞自噬自噬能够调节凋亡,为了了解SPC对心肌细胞自噬的影响,我们检测了SPC对H9c2细胞自噬指标的影响。Western blot结果显示SPC能够促进LC3 Ⅱ的积累。为了检测自噬小体的形成,我们转染GFP-LC3表达质粒进入H9c2细胞,荧光显微共聚焦检测发现,SPC处理组心肌细胞中GFP-LC3点状聚集显著增多。为了进一步明确SPC对自噬流的影响,我们检测了自噬的底物,P62。SPC促进p62的降解。Bafilomycin A1预处理H9c2细胞阻止自噬流进一步促进了SPC诱导的LC3 Ⅱ的积累,抑制了SPC引起的p62的降解。这些结果显示SPC能够促进H9c2细胞的自噬流。1.3 SPC通过诱导自噬抑制心肌细胞凋亡为了明确SPC诱导的自噬在心肌细胞凋亡中的作用,我们用自噬的抑制剂3MA抑制了SPC诱导的自噬,检测凋亡情况。Western blot结果显示,抑制自噬后逆转了SPC对凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 7切割的抑制作用。说明SPC通过诱导自噬抑制心肌细胞凋亡。1.4 SPC通过mTOR和JNK信号通路诱导自噬MTOR复合物mTORCl是自噬活性的主要控制中心。因此我们检测了mTORCl的活性。Western blot结果显示,SPC在5 min能够迅速促进mTORCl底物p70S6K和4EBP1磷酸化,但是在随后的12 h下调p70S6K和4EBP1磷酸化。因此,SPC能够调节mTORCl的活性。自噬主要由mTOR和Beclinl/Vps34两个复合物来调节,我们进一步检测SPC对Beclinl/Vps34的影响。Western blot结果显示,SPC并不影响Beclinl的水平,说明SPC诱导的自噬是beclin1非依赖的。JNK和p38MAPK,属于MAPK信号通路,在凋亡和自噬调节中具有重要作用。有研究表明SPC能够调节JNK和P38MAPK活性,因此我们检测了SPC对心肌细胞中这两种蛋白的活性影响。Western blot结果显示,SPC显著增强JNK的磷酸化但是并不影响p38MAPK活性。JNK的抑制剂SP600125预处理细胞能够逆转SPC对自噬的诱导作用。1.5 SPC是Akt的分子开关PI3K/Akt是mTOR和JNK的上游调节因子,并且是细胞存活及自噬的重要调控因子。因此,我们深入研究了SPC对Akt活性的影响。与mTORCl活性相对应,SPC也可以在早期5 mmin时激活Akt,而在随后的6h和12h抑制Akt的磷酸化。PI3K/Akt抑制剂LY294002和Wortmannin预处理1h进一步促了SPC诱导的自噬,说明对Akt/mTOR信号活性的抑制介导了SPC诱导的自噬。Akt具有三个亚型：Akt 1,Akt 2和Akt 3,我们利用免疫沉淀确定SPC主要调节了Aktl的活性。1.6细胞膜上的脂筏可能参与了SPC对PTEN/Akt及自噬信号的调控许多证据都表明细胞膜上的脂筏可以调控Akt的活性。Kobayashi等在SPC调节血管平滑肌细胞收缩机制的研究中提出了胆固醇对SPC信号调控的影响,进而提出脂筏可能是将胞外SPC信号传递到胞内的重要因素。因此,我们探究SPC是否通过脂伐来调节Akt活性以及细胞自噬。用p-环糊精预处理心肌细胞破坏膜上的脂筏,SPC抑制Akt磷酸化及诱导自噬的作用均被逆转,该过程中伴随PTEN磷酸化的变化,表明SPC是通过细胞膜上的脂筏传递信号,抑制PTEN磷酸化,从而激活其磷酸酯酶活性,抑制Akt的磷酸化,进而诱导自噬的发生。2.抑制非小细胞肺癌细胞的自噬显著的促进SPC引起的细胞死亡2.1 SPC促进非小细胞肺癌细胞的自噬由于SPC能够广泛促进血管内皮细胞和心肌细胞的自噬,我们推测SPC在诱导细胞自噬方面具有广谱性。因此我们研究了SPC对非小细胞肺癌细胞自噬的影响。Western blot检测自噬指标LC3-Ⅱ的水平表明,在A549和H157细胞中,SPC处理组LC3-Ⅱ水平显著的升高。自噬的抑制剂3MA预处理细胞30 min抑制了SPC诱导的自噬。而溶酶体蛋白酶抑制剂Pepstatin A预处理细胞4h阻断自噬流,进一步加剧了SPC引起LC3-Ⅱ的升高。因此,SPC能够促进非小细胞肺癌细胞的自噬。2.2 SPC引起非小细胞肺癌细胞的死亡自噬在肿瘤细胞的存活中扮演了双重角色,可能促进存活,也可能引起细胞死亡。我们进一步检测加入SPC非小细胞肺癌细胞的生长和存活情况。细胞形态变化以及SRB实验结果表明,5μM和10 μM浓度的SPC能够显著引起细胞的死亡。2.3 SPC抑制非小细胞肺癌细胞凋亡为了研究SPC引起非小细胞肺癌细胞死亡的方式,我们检测了SPC对细胞凋亡的影响。通过western blot检测细胞凋亡蛋白PARP1的切割显示,SPC显著抑制了A549细胞的PARP1蛋白的切割情况。因此,SPC并不是通过细胞凋亡来诱导细胞的死亡。2.4 SPC诱导非小细胞肺癌细胞坏死我们进一步检测SPC对细胞坏死的影响。LDH实验表明,SPC引起A549和H157肺癌细胞上清液中乳酸脱氢酶活性的显著升高。说明SPC可以引起细胞的坏死从而诱导细胞凋亡。2.5 SPC通过诱导自噬来抑制细胞的凋亡为了明确SPC诱导的自噬与细胞死亡的关系,我们利用自噬抑制剂3MA抑制自噬,研究SPC对细胞存活的影响。SRB实验结果表明,抑制自噬,细胞存活率进一步降低。我们进一步检测细胞坏死和凋亡的变化。结果表明,抑制自噬以后,SPC引起的LDH水平并没有发生显著变化。但是,细胞凋亡蛋白PARP1切割显著增加。以上结果表明,SPC通过诱导自噬抑制细胞的凋亡。2.6 SPC通过Akt/mTOR信号通路诱导自噬在心肌细胞中的研究表明SPC可以通过Akt/mTOR信号促进自噬,我们进一步在非小细胞肺癌细胞中验证该自噬调节机制。Western blot结果显示,10μM的SPC引起p70S6K和4EBP1 (mTOR的两个下游底物)的磷酸化水平显著降低,5 μM和10μM的SPC引起Akt的磷酸化水平的显著降低。因此,SPC通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导自噬。2.7 p53参与了SPC调节的自噬SPC诱导人类脐静脉内皮细胞中自噬的过程中,p53蛋白水平显著下调。我们进一步探究SPC在诱导非小细胞肺癌细胞自噬过程中,p53是否也参与了该过程。我们采用了p53野生的和缺失的两种细胞系：A549细胞和H1299细胞。实验结果表明,SPC能够诱导p53野生的A549细胞的自噬；却不能诱导缺失p53的H1299细胞的自噬。这一结果说明p53可能参与SPC诱导的非小细胞肺癌细胞的自噬过程。另外,我们还检测发现SPC能够引起线粒体膜电位和ROS水平的下降。