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苯是一种化学致癌物,长期慢性苯暴露可以导致再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、急性髓细胞性白血病及恶性淋巴瘤。骨髓是重要的造血器官,缺氧诱导因子HIF-1α在骨髓缺氧环境中可以通过多个细胞信号通路调节造血干细胞的代谢及生理功能。苯代谢物进入骨髓后,经氧化代谢产生大量的活性氧,引起氧化应激,破坏骨髓微环境,最终影响造血干细胞的迁移、发育和自我更新以及细胞周期状态。本研究主要通过构建苯中毒小鼠模型,检测骨髓细胞活性氧和HIF-1α及其调控的下游基因蛋白的表达水平,探索HIF-1α是否参与苯造血毒性及可能通路;进而使用1,4-苯醌染毒HIF-1α稳定高表达的细胞和对照细胞,检测细胞增殖、周期、凋亡、活性氧水平及下游基因的表达,研究HIF-1α可能通过调控哪些细胞功能影响1,4-苯醌的细胞毒性。最后,应用ChIP-Seq技术,筛选在苯中毒小鼠和对照小鼠骨髓细胞中有差异的与细胞功能相关的HIF-1α靶基因,为进一步研究HIF-1α在苯致骨髓造血毒性中的调节机制提供线索,进而为寻找慢性苯中毒的生物标志物提供方向。第一章苯暴露对小鼠骨髓细胞HIF-1α的调控作用研究应用不同剂量苯(60mg/(kg.d)、150mg/(kg.d)、300mg/(kg.d))染毒C57BL/6小鼠15天,构建苯中毒小鼠模型,检测小鼠体重、外周血常规、脏器系数和骨髓内造血干细胞比例。收集骨髓细胞,检测骨髓细胞中活性氧水平和HIF-1α及下游基因的蛋白表达水平。结果显示当中剂量(150mg/(kg.d))苯暴露时,外周血常规和造血干细胞比例与对照组相比显著降低,小鼠骨髓细胞活性氧水平升高明显;当高剂量(300mg/(kg.d))苯暴露时,第15天的体重和胸腺脏器系数与对照组相比显著降低。C57BL/6小鼠苯暴露15天后,中剂量和高剂量苯染毒组小鼠骨髓细胞内HIF-1α和BMI1蛋白表达水平显著降低,高剂量苯染毒组小鼠骨髓细胞内NOX4、VEGF和BCL2蛋白表达水平显著升高。以上结果表明,以150mg/(kg.d)的剂量染毒15天可成功构建苯中毒小鼠模型。苯中毒可使骨髓细胞活性氧生成增加,抑制HIF-1α的表达,进而影响HIF-1α下游基因BMI1和BCL2水平来参与苯致骨髓造血毒性。第二章HIF-1α参与1,4-苯醌致K562细胞毒性的作用研究本实验用慢病毒转染的方法构建HIF-1α稳定高表达K562细胞(K562-HIF-1α~+)和对照细胞(K562-NC)后,检测两株细胞HIF-1α蛋白的表达水平。不同浓度1,4-苯醌(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)染毒K562-HIF-1α~+和K562-NC细胞6小时、24小时或48小时后,检测细胞增殖、周期和凋亡的情况,以及细胞内活性氧水平和HIF-1α及下游基因的蛋白表达水平。结果显示,K562-HIF-1α~+细胞株中的HIF-1α表达水平明显高于对照细胞株K562-NC。1,4-苯醌染毒后,两株细胞的增殖率随着染毒浓度的升高而降低,10μmol/L和20μmol/L1,4-苯醌染毒24小时后,K562-HIF-1α~+细胞相对增殖率低于K562-NC细胞;正常培养未染毒的K562-HIF-1α~+细胞G0/G1期比例低于K562-NC细胞,G2/M期比例则高于K562-NC细胞,染毒浓度为10μmol/L时,K562-HIF-1α~+细胞S期比例高于K562-NC细胞;染毒后两株细胞凋亡率都升高,染毒浓度为40μmol/L时,K562-HIF-1α~+细胞早期凋亡和晚期凋亡比例低于K562-NC细胞;染毒浓度为40μmol/L时,两株细胞活性氧水平显著升高,且K562-HIF-1α~+细胞活性氧水平高于K562-NC细胞;染毒后K562-NC细胞PGK1、HIF-1α、PFKL和PKM2蛋白的表达水平升高,K562-HIF-1α~+细胞BCL2和PKM2蛋白的表达水平升高。以上结果表明,本实验成功构建HIF-1α稳定高表达K562细胞和对照细胞模型。在1,4-苯醌染毒条件下,HIF-1α可能通过调节细胞能量代谢相关的基因PGK1和PFKL来调控细胞周期和凋亡的过程。第三章HIF-1α对苯暴露小鼠骨髓细胞特异性调控的靶基因研究本章应用染色质免疫共沉淀测序技术,分析苯暴露小鼠和对照小鼠骨髓细胞中转录因子HIF-1α的全基因组结合谱,筛选在苯暴露引起的造血毒性过程中,HIF-1α参与调控的靶基因和造血功能相关通路。检测苯中毒小鼠骨髓细胞中HIF-1α靶基因的mRNA水平,将其结果与ChIP-Seq生物信息学结果比对,在mRNA水平验证ChIP-Seq结果,提高筛选HIF-1α靶基因的精确度。结果显示,和对照组相比,在启动子区,苯染毒组上调的差异基因有353个,下调的差异基因有245个。与对照组相比,苯染毒组GO分析下调的基因中生物过程部分的GO Term有101个。Pathway分析结果显示Jak-STAT信号通路是富集分数最高的下调通路。苯染毒组下调的差异基因中,42个基因的启动子区含有HIF-1α特异性结合位点,参考GO分析结果,发现其中23个基因与生物过程相关。苯中毒模型小鼠骨髓细胞内GRB2和PIK3CA基因的mRNA水平降低。以上结果表明,成功利用ChIP-Seq技术筛选出苯中毒小鼠和对照组骨髓细胞中表达有差异的HIF-1α靶基因。HIF-1α可能通过调节Jak-STAT通路中GRB2和PIK3CA基因的表达来调控苯中毒小鼠骨髓细胞功能。总结本研究发现苯中毒小鼠骨髓细胞中HIF-1α蛋白水平随活性氧水平的升高而降低,说明活性氧可能抑制骨髓细胞中HIF-1α蛋白的表达。苯中毒小鼠骨髓细胞中BMI1和BCL2蛋白的水平随HIF-1α蛋白表达水平的降低而降低,表明HIF-1α可能通过调节BMI1和BCL2水平来调控苯致骨髓造血毒性。对1,4-苯醌导致HIF-1α稳定高表达K562细胞毒性的研究表明,HIF-1α可能参与细胞周期与凋亡的调控过程,其可能通过调节细胞能量代谢相关的基因PGK1和PFKL来调控细胞功能。应用ChIP-Seq技术筛选出苯中毒小鼠和对照组骨髓细胞中表达有差异且与生物过程相关的HIF-1α的靶基因GRB2和PIK3CA,其在HIF-1α的调控下可能参与调节苯中毒小鼠骨髓细胞功能。