由希金斯刺盘孢引起的炭疽病是十字花科蔬菜生产上的毁灭性病害之一。近年来，希金斯刺盘孢全基因组序列的公布和遗传转化体系的完善加速了希金斯刺盘孢致病相关基因的发掘和鉴定，同时也为从基因组水平上深入研究希金斯刺盘孢致病分子机制提供了新的平台。本研究对希金斯刺盘孢致病缺陷突变体Ch-1-G281的ChRgf基因和突变体Ch-1-E240的ChAcs基因的功能进行了研究，并观察了希金斯刺盘孢侵染荧光标记拟南芥植株寄主活体营养阶段的亚细胞反应，主要结果如下:　　(1)利用农杆菌介导的转化方法构建了希金斯刺盘孢Ch-1菌株的T-DNA插入突变体库，获得了2000个转化子。通过将突变体分生孢子接种拟南芥植株，观察接种第4天的发病症状及突变体侵染结构的形成情况，筛选得到了7株致病缺陷型突变体，分别为致病丧失突变体Ch-1-G281及致病减弱突变体Ch-1-G090、Ch-1-G256、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240。通过Southern杂交验证了7株致病缺陷型突变体的T-DNA插入拷贝数，其中Ch-1-G256、Ch-1-G281、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240为单拷贝插入，而Ch-1-G090为双拷贝插入。通过Inverse-PCR对致病缺陷型的侧翼序列进行扩增，分别获得了7个T-DNA插入突变体的侧翼序列。侧翼序列分析结果显示:突变体Ch-1-G281T-DNA插入破坏了RasGEF（Ch063_04179）基因，该基因全长3057bp，编码1018个氨基酸，有4个外显子，3个内含子。突变体Ch-1-G090T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_10682)基因，该基因全长543bp，编码180个氨基酸，有1个外显子;另一个插入位点破坏了RNA加工蛋白FCF1(Ch063_10671)，基因全长324bp，编码108个氨基酸，有2个外显子，1个内含子。突变体Ch-1-G256T-DNA插入破坏了乳糖透过酶(Ch063_16024)基因，该基因全长477bp，编码159个氨基酸，有2个外显子，1个内含子。突变体Ch-1-G310T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_15059)基因，该基因全长243bp，编码80个氨基酸，有1个外显子。突变体Ch-1-G323T-DNA插入破坏了丝氨酸苏氨酸激酶cot-1(Ch063_12968)基因，该基因全长1983bp，编码660个氨基酸，有4个外显子，3个内含子。突变体Ch-1-G668T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_01887)基因，该基因全长645bp，编码214个氨基酸，有1个外显子。以及突变体Ch-1-E240T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶（Ch063_08070）基因，该基因全长1275bp，编码424个氨基酸，有4个外显子，3个内含子。　　(2)T-DNA插入突变体Ch-1-G281在PDA上的菌落形态变化较大，其菌丝生长速度变慢，菌丝呈多分支状。突变体分生孢子产量降低，孢子液喷雾接种拟南芥叶片后，分生孢子不能在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞，推测该基因影响了分生孢子的萌发以及附着胞的形成。证实T-DNA插入破坏了Ras鸟氨酸交换因子（ChRgf)，ChRgf基因全长为3276bp，编码1018个氨基酸。敲除ChRgf基因影响了希金斯刺盘孢的营养生长和菌丝形态，敲除转化子⊿ChRgf-42生长缓慢，菌丝呈现多分枝;产孢量显著下降，仅为野生型的8％;在塑料玻片上诱导孢子萌发，孢子萌发率明显降低，为野生型的50％，萌发的孢子不能正常形成附着胞，而附着胞产率约为野生型及互补突变体的5-10％，而附着胞膨压与野生型菌株并无明显差异。敲除转化子⊿ChRgf-42孢子液喷雾接种拟南芥叶片后，敲除转化子⊿ChRgf-42分生孢子不能在叶片表面萌发并产生黑化的附着胞。敲除转化子⊿ChRgf-42孢内cAMP含量显著降低，仅为野生型胞内cAMP含量的60％，外源加入cAMP以及IBMX可使敲除转化子⊿ChRgf-42对外界疏水信号产生响应。敲除转化子⊿ChRgf-42对外界胁迫如NaC1，KCl的耐受性增强。基因互补实验结果表明，基因敲除菌株的产孢、萌发、附着胞形成及致病性均恢复至野生菌株水平。表明希金斯刺盘孢ChRg基因作为cAMP，Ras等通路的上游调控因子在调控营养生长、产孢以及致病相关的侵染结构的发育等方面具有重要的生物学功能。　　(3)T-DNA插入突变体Ch-1-E240在菌丝生长、产孢、孢子萌发及附着胞形成等方面与出发菌株Ch-1相比没有显著差异。孢子液喷雾接种拟南芥植株后拟南芥植株发病严重度低于野生型，显微观察表明分生孢子在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞，能正常侵染产生初生菌丝，但次生菌丝产量明显降低，推测该基因影响了次生菌丝的产生。T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶基因(ChAcs1)，ChAcs1基因全长为1441bp，编码432个氨基酸。生物信息学分析发现，希金斯刺盘孢中有两个乙酰辅酶A合成酶编码基因，分别命名为ChAcs1(Ch063_08070)和ChAcs2(Ch063_00691)，采用基因敲除和互补策略，分别对这两个基因进行了功能分析:ChA cs1基因敲除对希金斯刺盘孢的营养生长、产孢和附着胞的形成与野生型无明显差异;ChAcs2基因敲除无明显的表型改变。通过GFP融合表达及蛋白定位分析，发现ChAcs1蛋白、ChAcs2蛋白的表达分布于整个细胞质。⊿Chacs1不能利用乙醛、乙醇、乙酸等非发酵碳源，胞内脂质含量下降。⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥叶片4天后，植株发病严重度低于野生型，只有47％的初生菌丝能正常发育并形成次生菌丝;而⊿Chacs2敲除转化子对致病性无明显影响。对⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥活体营养阶段（侵染40小时后）进行全基因组RNA-seq分析，表明ChAcs1参与调控了一系列与致病、乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环以及乙醛酸循环相关的基因，致病相关基因如MAPK，STE7等基因下调表达，乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环中重要节点基因如乙醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶等基因下调表达。基因互补实验结果表明，基因敲除菌株的致病性恢复至野生菌株水平。以上结果表明ChAcs1可能参与调控了丙酮酸-乙醛-乙酸代谢途径，在调控脂类代谢、致病相关侵染结构如次生菌丝的形成等方面具有重要的生物学功能。　　(4)用希金斯刺盘孢侵染不同荧光蛋白标记的转基因拟南芥植株，以研究拟南芥与希金斯刺盘孢互作过程中的活体营养界面的膜区室的重分布。在活体营养寄生阶段，寄主细胞的质膜蛋白表现出不同的定位模式，肉豆蔻酰化和棕榈酰化蛋白MAP，异戊二烯蛋白PAP，低温诱导蛋白LTI6b均定位于活养寄生界面，突触融合蛋白PEN1与ABC转运蛋白PEN3定位于初级初生菌丝的活养寄生界面，质膜H+-ATP酶PMA与质膜固有蛋白PIP2定位于初生菌丝的基部。与此同时，寄主细胞细胞膜脂也在初生菌丝侵染阶段呈现出不同的定位模式:磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P定位于初生菌丝的基部，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸PI(4，5)P2定位于活体营养界面，磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养寄生界面。同时磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养界面说明液泡也参与了活养界面的合成以及互作。后期由不同的液泡膜标记蛋白包括液泡膜水通道蛋白以及囊泡相关蛋白VAMP711均包裹初生菌丝界面，证明了液泡参与初生菌丝界面的互作过程。随着初生菌丝的发展，液泡逐渐变小，直至液泡膜破裂，与此同时，粗大的初生菌丝向细长的次生菌丝进行转化，说明寄主细胞死亡与液泡的破裂以及初生菌丝向次生菌丝转变是同一时间点发生的。此外，内吞囊泡ARA7/RABF2b单一定位于初生菌丝的活体营养界面说明寄主细胞的内吞性质发生了改变。上述研究结果表明，希金斯刺盘孢与拟南芥互作过程中存在特殊的活养寄生界面，这一活养寄生界面可能是通过细胞膜的分化或者通过囊泡运输而来，同时，液泡也参与了活养寄生界面的形成。