谷胱甘肽—S—转移酶(GSTs)是一个多功能的超家族酶类，广泛分布于动物、植物、酵母和细菌等生物体中。GSTs在昆虫对有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中起着重要的作用。农药在害虫防治中起着非常重要的作用，但随着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们不断开发新的农药产品或增加农药的用量，这不但制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响到了经济和人类的可持续性发展。世界上50％以上的农林害虫属于鳞翅目，家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物和重要的经济昆虫，是目前唯一完成了基因组测序的鳞翅目昆虫。对家蚕GST基因进行研究，不仅能为家蚕抗性品系的育成提供理论依据，也可为开展鳞翅目昆虫的生物防治奠定基础。本文采用生物信息学分析方法，依据家蚕基因组数据库和EST数据库信息，预测了家蚕的谷胱甘肽—S—转移酶基因BmGSTe4，采用RT—PCR方法分析了其组织表达特性并进行了序列分析。利用基因工程技术，克隆谷胱甘肽—S—转移酶后，通过杆状病毒表达载体系统构建了BmGSTe4基因的真核表达载体，对BmGSTe4基因进行了真核表达，并对表达产物进行了western blot验证和酶活性测定，获得结果如下： 1．BmGSTe4基因的克隆和序列分析。克隆了家蚕的BmGSTe4基因，该基因的完整编码区序列长度为654bp，由5个外显子与4个内含子组成，内含子总长度为3631bp，最长内含子为1949bp，最短内含子为214bp。BmGSTe4包含N—末端和C—末端两个结构域，N—末端由β—α—β—α—β—β—α共7个结构基序组成，而C—末端则由6个α螺旋构成，有一个保守的Ser催化位点。以神经网络启动子预测分析发现，BmGSTe4有1个TATA盒，在上游2500bp区域内搜寻相关调控元件时，共发现了14个可能的转录调控元件，分别是：XRE(1)、ARE(6)、TRE(5)和NF—kB(2)。系统发生树明显分为四大类群，分别是Dlata、Epsilon、Theta和Zeta四大类。而家蚕BmGSTe4与昆虫特异的Epsilon家族聚为一类。 2．BmGSTe4基因的表达模式分析。检测发现BmGSTe4基因只在表皮和头部有表达，在其余6个组织中基本不表达，并且在表皮中表达量较头部表达量高。表明BmGSTe4基因的表达具有较高的组织特异性。 3．BmGSTe4基因的真核表达。运用cellfectin转染试剂将重组病毒转染进入sf9细胞后，经SDS—PAGE分析鉴定，比较蛋白条带，结果发现感染重组杆状病毒Bacmid—BmGSTe4的细胞沉淀有—约为27kD左右的目的特异蛋白条带表达。 4．wester blot验证。感染重组杆状病毒Bacmid—BmGSTe4的细胞沉淀经SDS—PAGE电泳完后切取62kD和14kD之间的胶进行转膜和Western blotting杂交。在样品检测到杂交信号。表明，目的基因已在细胞内表达。 5．GSTs酶活性测定。以CDNB作底物，对重组表达蛋白酶进行初步的酶活性测定，结果表明外源表达的GST蛋白酶具有较好的生物学活性，为BmGSTe4蛋白进一步的功能研究奠定了基础。