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第一部分TGF-β1诱导下前列腺癌干细胞富集化的蛋白组学研究目的:验证TGF-β1对前列腺癌干细胞富集化的作用,并探索在TGF-β1诱导前列腺癌干细胞富集化过程中可能的关键性蛋白。方法:LNCa P和DU145细胞通过TGF-β1诱导7天后,用流式细胞分析技术鉴定通过TGF-β1处理的细胞和对照组细胞的干细胞标志物CD44和CD24的表达情况。并进一步在诱导组和对照组中分选出CD44+/CD24-细胞,分析它们干细胞标志物CD133和α2β1Integrin的标志物表达情况。然后对上述LNCa P的分选细胞采用质谱法进行蛋白组学分析,筛选出差异蛋白,并用Western blot验证该蛋白在LNCa P和DU145细胞富集化过程中的表达情况。结果:TGF-β1诱导后,LNCa P和DU145细胞中的CD44+/CD24-细胞与对照组相比呈现富集化。诱导组和对照组分别用流式分选出CD44+/CD24-细胞,发现前者的CD133和α2β1Integrin与后者相比呈现高表达(LNCa P和DU145细胞均观察到此现象)。通过质谱分析技术进行蛋白组学分析LNCa P细胞,得到TGF-β1诱导组和对照组相比有63种蛋白出现5倍以上的上调或者下调,其中PCBP-1下调最明显(9.31±0.05倍)。通过Western blot验证了,TGF-β1诱导LNCa P和DU145细胞的过程中,PCBP-1蛋白表达逐步下调。结论:TGF-β1诱导下,LNCa P和DU145细胞中的CD44+/CD24-细胞显著富集化。并且这部分细胞高表达干细胞标志物CD133+/α2β1Integrin+。在上述干细胞类细胞富集化的同时,伴随着PCBP-1的显著下调。第二部分PCBP-1对前列腺癌干细胞增殖及成瘤能力调节的研究目的:验证PCBP-1的下调是否是TGF-β1诱导前列腺癌干细胞富集化的关键因素,以及PCBP-1蛋白对前列腺癌干细胞增殖及成瘤能力的影响。方法:通过转染上调LNCa P和DU145细胞中的PCBP-1蛋白表达并用Western blot验证蛋白表达情况。获得上调PCBP-1的上述细胞后,经过TGF-β1诱导后,流式细胞分析过表达组与对照组中细胞CD44、CD24和CD133表达的情况。运用q RT-PCR检测PCBP-1对干细胞标志物CD44、CD24和CD133 m RNA的影响。在过表达组与对照组中分选出CD44+/CD24-细胞,行软琼脂克隆成球实验验证干细胞增殖能力。选用上述干细胞的克隆球,检测其在裸鼠的体外成瘤能力。结果:将p CMV-AC-PCBP1-GFP质粒,转染入LNCa P和DU145细胞中,通过G418筛选后获得稳定的克隆,通过荧光显微镜和Western blot均证实PCBP-1高表达。上述细胞经过TGF-β1诱导后,经过流式细胞检测,与对照组相比,干细胞富集化明显降低(CD44+/CD24-/CD133+)。q RT-PCR检测显示,PCBP1的高表达与CD24在RNA水平的上调显著相关(P<0.05),与CD133在RNA水平的下调显著相关(P<0.05)。软琼脂克隆成球实验和裸鼠体内成瘤能力检测证实,对照组的LNCa P和DU145干细胞增殖和成瘤能力非常强,而PCBP-1明显抑制了这些干细胞的特性。结论:PCBP-1对前列腺癌干细胞富集化、增殖和成瘤能力起到了负性调节作用。