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研究背景和目的目前,肺癌在男性和女性癌症相关死亡中均居首位,在我国,每年肺癌发病约78.1万,死亡病例约为62.6万。肺癌分为两种类型:非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌占肺癌的85%,其包括三种亚型,即腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。在所有肺癌患者中,肺腺癌可占50%以上,是肺癌的主要亚型。在过去的几十年里,针对肺腺癌的靶向治疗、免疫治疗以及新型抗癌药物的开发取得巨大的进展,但肺腺癌仍然是最常见、最致命的恶性肿瘤之一,因其早期无明显症状,往往诊断较晚,且晚期肺腺癌患者,对药物的耐药性和高转移率是疾病恶化和治疗失败的主要原因,故肺腺癌患者的5年生存率低于18%。因此,迫切需要进一步研究肺腺癌发生和发展的新分子机制,以发现潜在的肺腺癌预后和潜在治疗靶标的新因素。近年来,随着基因组测序的进一步完善、生物芯片的大量普及以及大数据的开放和使用,大量的生物信息学被广泛应用于临床研究,产生了大量的疾病相关数据,越来越多的研究者开始使用生物信息学来分析肺癌组织与癌旁组织中的差异表达基因,这将为肺癌的诊断和治疗提供更有意义的手段,并为更有效的治疗策略找到更多的潜在靶点。本研究通过公共基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中筛选出 GSE116959、GSE19188 两组基因集,鉴定出参与非小细胞肺癌发生发展的核心基因,并通过生物信息学分析探索了它们的功能。随后从筛选出的核心基因中选择ASPM基因作为后续研究目标。人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(abnormal spindle-like microcephaly-associated protein,ASPM)主要是在细胞有丝分裂纺锤体调节和有丝分裂过程的协调中发挥作用,ASPM高表达可促进肝癌、膀胱癌、卵巢癌等肿瘤发生,并驱动肿瘤细胞增殖、侵袭和自我更新。肺腺癌作为肺癌主要的亚型,目前ASPM在肺腺癌组织中研究较少,该基因在肺腺癌发生发展中的相关机制及作用尚不清楚。本研究随后通过对TCGA数据集、免疫组化分析并探讨ASPM表达水平与肺腺癌患者的临床病理特征、预后关系;并通过体外实验研究ASPM对肺腺癌增殖、侵袭的影响及可能促进肺腺癌发展的机制,从而为肺腺癌的治疗提供一个新的潜在靶标。方法1.从GEO数据库中筛选出符合条件的非小细胞肺癌芯片数据集GSE116959和GSE19188,其中GSE116959数据集包括57个肺腺癌组织与11个正常组织;GSE19188包括91个非小细胞肺癌组织与65个正常组织。2.应用R语言对原始数据进行处理,以|Log2(FC)|≥1、P<0.05为标准筛选出差异表达基因,并使用RobustRankAggreg软件包对两个数据集中获得的差异表达基因进行整合。使用FunRich软件对上调和下调的差异表达基因进行功能富集,包括分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological pathway,BP)和生物途径(biological pathway,BPA)。3.应用 String(the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,String)数据库及Cytoscape软件绘制差异表达基因的蛋白-蛋白交互作用网络图,并使用 Cytoscape 中 MCODE(Molecular Complex Detection,MCODE)插件鉴定出核心基因。4.通过TCGA数据库下载ASPM mRNA在肺腺癌中的表达数据及相关病理参数,分析ASPM mRNA表达水平与临床病理特征和预后的关系。收集55例肺腺癌术后患者癌组织及30例与之配对的癌旁组织标本,应用免疫组化测定ASPM蛋白在肺腺癌组织中的表达水平,同时分析ASPM蛋白表达水平与临床病理特征和预后的关系。5.选择肺腺癌细胞系A549、H1650细胞株用于后续体外实验。利用质粒转染技术敲低ASPM表达,并经蛋白印迹方法确认后,使用CCK-8、平板克隆检测ASPM敲低对肺腺癌细胞增殖能力的影响;Transwell及划痕实验检测ASPM敲低对肺腺癌细胞侵袭能力的影响,流式细胞术检测ASPM敲低对肺腺癌细胞周期的影响。6.通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)预测 ASPM 可能参与肺腺癌发展的通路,并采用蛋白印迹检测ASPM对信号通路部分指标的影响,探索ASPM在肺腺癌进展中的生物学功能。结果1.对GSE116959和GSE19188两个数据集进行整合分析,得出287个上调和551个下调差异表达基因。通过string数据库及Cytoscape软件进行后续分析,得出重要基因模块,连接度高的6个核心基因KIAA0101、PBK、UBE2C、ASPM、TOP2A、CEP55与肺腺癌患者的OS相关,可能是肺腺癌潜在的预后指标。通路分析结果显示其与细胞周期密切相关。2.ASPM mRNA在肺腺癌组织中高表达(P<0.001),并与淋巴结转移、远处转移、生存状态以及TNM分期显著相关(P=0.046,P=0.031,P<0.001,P=0.029)。COX 回归分析显示 ASPM mRNA 表达水平(HR=1.754,P=0.002)、T 分期(HR=2.010,P=0.002)、N 分期(HR=2.001,P<0.001)是肺腺癌总生存率(Overall Survival,OS)的独立预后因素。3.ASPM蛋白在肺腺癌组织高表达(P<0.001),并与淋巴结转移显著相关(P=0.011)。COX回归分析结果表明,ASPM蛋白表达水平(HR=3.853,P=0.004)、淋巴结转移(HR=3.223,P=0.012)、性别(HR=2.851,P=0.004)是患者OS的独立预后因素;ASPM蛋白表达水平(HR=2.373,P=0.022)、淋巴结转移(HR=1.959,P=0.030)是患者无复发生存期(Recurrence free survival,RFS)的独立预后因素。4.体外实验结果显示,敲低ASPM表达后肺腺癌细胞增殖和克隆形成数量显著减少,细胞周期被阻滞在G0/G1期,细胞侵袭能力显著下降。5.GSEA分析结果显示ASPM mRNA高表达组显著富集在Wnt信号通路上,western blot实验证实:敲低ASPM表达后可降低Wnt信号通路上部分分子β-catenin、c-myc、survivin 表达水平。结论KIAA0101、PBK、UBE2C、ASPM、TOP2A、CEP55 可能在非小细胞肺癌发生发展中至关重要。高表达水平的ASPM mRNA和蛋白是肺腺癌患者OS的独立预后因素。体外实验中敲低ASPM表达可抑制肺腺癌细胞增殖、侵袭能力,细胞周期被阻滞在G0/G1期,并可能通过Wnt信号通路参与肺腺癌发展。ASPM有望成为肺腺癌新的治疗靶点,为肺腺癌的靶向治疗提供了新的思路。