三维立体培养中肺癌细胞基质金属蛋白酶的表达

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肺癌的发病率和死亡率居所有癌症的首位,其发病机制的研究也一直是热点。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌离子依赖性的、在结构上具有极大同源性的内肽酶家族,能降解细胞外基质,其过度表达在肿瘤的生长、侵袭和转移中有着重要作用,因而被广泛关注和研究。本课题采用三维立体培养技术,研究肺癌细胞基质金属蛋白酶的表达情况,以探讨基质金属蛋白酶在肺癌侵袭与转移中的作用及机制。首先建立肺癌细胞的三维立体培养模型。采用人非小细胞肺癌H460细胞株传代培养,用鼠尾制取Ⅰ型胶原,并制备等离子、等渗、1×DMEM、胶原浓度为0.75mg/mL的液体胶原,按4×10~5个/mL接种H460细胞于胶原内,建立三维立体培养,同时建立平面培养作为对照,在24、72、120h观察细胞生长状况,用数码照相机记录,并收集细胞培养液,用明胶酶谱电泳的方法测定其中的MMP-2、MMP-9。然后将单个核细胞、肺成纤维细胞分别与H460细胞混和立体培养。单个核细胞采集自健康志愿者外周血,采用单个核细胞分离液分离制备,人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株传代培养,分别将两种细胞与H460细胞混和立体培养,定时观察、记录细胞生长情况,收集培养液,用明胶酶谱电泳的方法测定其中的MMP-2、MMP-9,采用Bergman法测定其中的羟脯氨酸含量,计算胶原降解量。再者在H460细胞立体培养中加入TNF-α干预因素,同样方法测定MMP-2、MMP-9和羟脯氨酸含量。最后采用明胶酶谱电泳法测定36例非小细胞肺癌患者血清和23例恶性胸水的MMP-2、MMP-9,同时测定10例健康志愿者血清和15例非恶性胸水作为对照,并用Bandscan分析软件测定电泳条带灰度值。本实验成功建立了肺癌细胞的三维立体培养模型,癌细胞及肺成纤维细胞等生长状况良好,H460细胞在立体培养条件下MMP-2、MMP-9表达比平面培养增强。H460细胞与单个核细胞混和立体培养,电泳显示MMP-2、MMP-9的表达混合组最强,其次是H460组,单个核细胞组表达不明显;胶原分解量也是混和组最高,单个核细胞组最低,组间比较差异显著(P<0.05)。H460细胞与MRC-5混和立体培养,电泳显示MMP-2、MMP-9的表达MRC-5组最强,其次为混合组,H460组表达最弱;胶原降解量同样是MRC-5组最高,H460组最低,组间比较差异显著(P<0.05)。在H460细胞的立体培养中加入TNF-α干预,电泳显示MMP-2、MMP-9表达较空白对照组增强,胶原分解量增多,有显著性差异(P<0.05)。血清标本电泳MMP-2在非小细胞肺癌患者及健康志愿者均有表达,MMP-2条带灰度测定差异不显著(P>0.05)。胸水标本电泳MMP-2、MMP-9结果显示:在恶性胸水中表达最高,漏出性胸腔积液表达最低。MMP-2条带灰度测定显示:恶性胸腔积液组测定值最高,其次为渗出性结核性胸膜炎组,漏出性胸腔积液组最低。恶性胸腔积液组、结核性胸膜炎组与漏出性胸腔积液组比较差异显著(P<0.05),但前两者之间无明显差异(P>0.05)。研究认为三维立体培养是一种能较好模拟体内环境的研究模型,在肺癌细胞生物学特性的复制与研究方面有很大优势。我们运用这一模型发现:单个核细胞与肺癌细胞混和培养后,刺激MMP-2、MMP-9分泌增多,活性增强;肺成纤维细胞与肺癌细胞混合培养,刺激MMP-2、MMP-9表达的同时,可能更多的刺激了TIMPs的表达增强;TNF-α对肺癌细胞MMP-2、MMP-9的表达有上调的作用。血清中MMP-2的表达差异不显著,可能需要进一步增加样本深入研究后才能明确其临床意义;胸水中MMP-2、MMP-9的表达增强提示可能为恶性病变。
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