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目的构建pcsk9功能获得型突变与功能缺失型突变基因真核表达载体,并完成初步鉴定,为明确pcsk9与内皮细胞损伤和泡沫细胞形成的具体联系提供研究手段,为研究As机制及防治提供新的思路。方法1.培养人肝细胞株(BLE7402),收集细胞提取RNA,去除DNA,反转录合成cDNA第1链。以cDNA第1链为模板,扩增pcsk9基因编码区全长,鉴定扩增产物。按照Target clone-plus试剂盒操作说明对pcsk9进行加A反应,纯化,将pcsk9 cDNA与pMD18-T载体连接。将pMD18-T- pcsk9载体转化入DH-5α大肠杆菌感受态细胞,利用含AmpLB的固体平板倒置培养,挑取单克隆,摇菌,提取质粒,Hind III和XbaI酶切,测序鉴定。提取pMD18-T- pcsk9,设计引物扩增,在其3’端添加Flag标签,酶切,纯化。同法将pcDNA4.0转化扩增,提取质粒,酶切纯化后与pcsk9-Flag连接,构建pcDNA4.0- pcsk9质粒,去除内毒素。2.选择pcsk9获得型突变(S127R)与缺失型突变(L253F),分别设计定点突变引物,以野生型pcsk9载体为模板定点诱变,构建pcsk9两种突变型真核表达载体。如上将突变型质粒转化感受态细菌XL10GOLD,提取质粒,测序验证并去除内毒素。3.培养THP-1细胞至最佳状态,细胞计数,分入24孔板。按照Lipofectamine? LTX转染说明,分别pcsk9野生型质粒、pcsk9- S127R质粒、pcsk9- L253F质粒转染进入THP-1细胞,24小时后用佛波酯诱导,并在荧光显微镜下观察转染结果。4.利用RT-PCR、Western blot检测转染后THP-1细胞pcsk9 mRNA和蛋白、LDLR表达情况,进一步验证转染是否成功。结果提取总RNA,取5μl稀释100倍测OD值为1.9,电泳发现28S rRNA、18S rRNA条带清晰,前者亮度约为后者1.5-2.0倍,5S rRNA条带模糊。扩增pcsk9基因编码区全长,电泳图上发现2.1kb左右的条带,与pcsk9基因编码区(2079bp)大小相符。pMD18-T- pcsk9载体转化16h,出现散在白色菌落。基因测序发现所测基因与pcsk9同一性100%,碱基缺失率0%。构建pcsk9野生型真核表达载体,酶切电泳发现2.1 kb和5.1 kb处分别出现条带,与pcsk9基因(2079bp)和pcDNA4.0(5078bp)载体大小相符。构建功能获得型突变pcDNA4.0- pcsk9-S127R真核表达载体,测序发现pcsk9DNA第381位碱基由T变成A,构建功能缺失型突变pcDNA4.0- pcsk9-L253F真核表达载体,测序发现pcsk9 DNA第757位碱基由C变成T。将pcsk9野生型质粒、pcsk9- S127R质粒、pcsk9- L253F质粒转染进入THP- 1,荧光显微镜下发现正常对照组无发绿色荧光细胞,pcsk9野生型质粒组、pcsk9- S127R质粒组、pcsk9- L253F质粒组有发绿色荧光细胞。检测转染后THP-1 pcsk9mRNA表达情况,电泳发现正常对照组无条带,pcsk9野生型质粒组、pcsk9- S127R质粒组、pcsk9- L253F质粒组有大小相似条带。检测转染后THP-1 PCSK9蛋白表达情况,Western blot分析发现60KD处(PCSK9)正常对照组无条带,pcsk9野生型质粒组、pcsk9- S127R质粒组、pcsk9- L253F质粒组有大小相似条带。检测转染后THP-1 LDLR蛋白表达情况,Western blot分析发现93KD处(LDLR大小)处pcsk9- L253F质粒组条带灰度值最大,正常对照组次之,pcsk9野生型质粒组第三,pcsk9- S127R质粒组最小,方差分析,发现组间差异有显著性(p<0.05)。结论构建了pcsk9功能获得型(S127R)和功能缺失型(L253F)突变真核表达载体,并验证其构建成功,为明确pcsk9与内皮损伤和泡沫细胞形成的具体联系提供了研究手段,为研究As机制及防治提供了新的思路。