1.背景与目的：肝脏是维持机体内环境稳定和机体健康的最重要的器官之一,脂肪肝、肝炎、肝硬化和原发性肝癌是肝内最常见的四大严重疾病,也是危害人类健康的重要原因之一。事实上,每年大约有一百万人死于肝炎病毒感染及其导致的肝硬化和肝癌。特别需要指出的是,作为肝脏最常见的原发恶性肿瘤—原发性肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma HCC)因为发病率较高、发现困难、治疗方法少等原因已经在导致人类死亡的各种疾病中位居前列。目前,原发性肝细胞性肝癌在全球范围内肿瘤致死率方面位列第五位,而在一些非洲和亚洲国家,原发性肝细胞性肝癌在肿瘤性死因中已经位居首位。肝癌所导致的人力、财力、物力和医疗资源的大量消耗在我国更加明显,主要原因在于世界上几乎一半的新发病例出现我国,以2000年为例,全世界新发病例总数62.4万人,发生在我国的大约占其中得55%,这个数字实在有点触目惊心。据我国卫生部统计,从20世纪90年代起原发性肝癌(PHC)已经演变为第二位的癌症杀手,在城市仅次于肺癌,在农村仅次于胃癌。而与此相对应的现实是：肝癌每年新发病例已达564000例,而死亡病例也有549000例之多。由于没有切实有效的早期诊断方法,发现时已处于中晚期；加上没有合理有效的根治方案,手术效果较差,化疗和放疗的效果也不明显,造成肝癌病人的5年生存率很低,复发率和死亡率很高。曾有报道指出肝癌根治切除术后5年复发率为51.6%,其中小肝癌的复发率就高达43.6%。虽然除手术根治术以外,还有一些新的治疗方法进入临床(如射频消融治疗、微波治疗、冷冻消融治疗、无水酒精瘤内注射、肝动脉介入栓塞化疗等局部治疗手段),但这些方法对于提高肝癌的总的生存质量效果收效甚微。早发现才能早治疗,因此,肝癌的早期诊断早已经成为人们关注的焦点,但遗憾的是实际有效的方案仍然欠缺,早期发现肝癌仍然是巨大的挑战。在医学科学日益发展的今天,虽然在诊断领域的投入已经越来越多,但有效的标志物的成果还是寥寥无几。事实上,很多我们眼中可能是早期肝癌的病人,在治疗的过程中却发现其实肿瘤细胞已经长期存在并发生了转移,患者已是处于肿瘤的中、晚期,各种现象都表明目前的检测技术仍然不能及时发现和有效检测早期阶段的肝癌。这也是有很大一部分所谓的“早期”患者在实施完手术后,却很快发生了复发。所以,对于肿瘤标志物的寻找仍然是一个重要方向,也是肿瘤早期发现的重要方法。由于血清检测的灵敏度高,操作便捷、不仅对判断肿瘤的发生、转移、复发有重要价值,而且对指导临床治疗,改善患者预后有重要意义,因此血清学标志物的研究是目前研究的一个热点,也是难点和重点。肝细胞癌是常见的恶性程度极高的肿瘤,其发病存在一定的区域分布特性,其中,在肝炎病毒流行的亚洲和非洲,发病率相对较高。在肝癌的普查上,常规的肝癌易感个体的普查可以明显延长很多病人的生存期,但是对于许多晚期肝癌病人来说,效果仍然不容乐观。对于一部分晚期肝癌患者,虽然只有很小的肿瘤,外科手术也完全切除,但是术后长期生存质量的改善却很不明显,而术后肝内或肝外转移及复发就是肝癌病人预后极差的主要原因。事实上,目前术后复发和转移的估计常常不足或过度,往往会造成术后治疗不当,对于病人来说无疑又是一个不利因素。许多研究证实炎症、免疫、肿瘤三者有着密切的关系。目前认为炎症反应在肿瘤的发生、进展、恶性转化、侵袭和转移中都扮演了重要角色。同时在机体炎症过程和免疫应答两者之间又有着密切的关系,已有学者提出有1/5的癌症是与慢性感染相关。炎症和肿瘤是一对矛盾体,Dvorak HF等将肿瘤称为“不能愈合的伤口”,Schrader J提出肿瘤一方面利用促炎的微环境来进行组织重塑、血管生成和发生侵犯和转移;另一方面通过促进抑制性巨噬细胞生成、聚集Treg细胞来抑CTLs的作用,从而阻止免疫系统攻击肿瘤细胞。肿瘤作为对机体的一种损伤,在其发生发展的过程中,机体也会出现相应的炎症反应,特别是对于恶性肿瘤,因为是破坏性比较强,激起病人的自我防御机制也会相对明显一些。鉴于炎症与肿瘤的密切联系,对于肿瘤发生过程中炎症相关因素的参与的研究也就成为了一个重要的方向。HTATIP2TIP30(HIV-I Tat interactive protein2)又名CC3,是人类免疫缺陷病毒在体外转录时发现的一种分子量30kd的结合蛋白(Tat interactive protain, TIP30),其作为HIV转录的辅助因子可以和Tat相互结合特异性提高HIV增殖。以往的研究认为HTATIP2/TIP30是一种被广泛表达于人体组织和一些肿瘤组织中抑癌基因。HTATIP2/TIP30能够与已知的酪氨酸激酶抑制剂,血管生成抑制剂共同参与细胞周期和细胞凋亡相互作用。XiaoHua等研究发现,在杂合背景下(50%来源于C57BJ6小鼠和Svj129来源于svJ129小鼠),Tip30基因敲除可导致约30%的小鼠发生原发性肝癌,在人原发性肝癌的免疫组化检查中发现33%的原发性肝细胞癌TIP30蛋白表达低于正常肝组织。Zhao等的研究发现TIP30高表达可抑制肝癌的转移,同时TIP30可通过多种机制抑制肝细胞的凋亡。HTATIP2/TIP30可通过与DNA结合、跟RNA多聚酶II形成复合物等调节细胞增殖、凋亡及血管生成相关基因而达到抑制肿瘤转移的作用。Budhu A等利用肝癌癌旁组织基因的17个细胞因子表达谱与其他临床预后指标相比,发现他们可以作为独立预后因子,Thl/Th2细胞因子失衡对于肿瘤预后预测有重要的意义。他们认为不同转移潜能肝脏微环境中有着截然不同的优势细胞因子表达谱,微环境由抗炎状态向免疫抑制,这些研究也揭示了细胞因子改变与肿瘤复发转移的关系。TNF-α和IL-1β在原发性肝癌中表达高于正常人,另外癌旁这两个因子也增高,MIF等另外的血管生成相关基因都与肝癌肝内转移有关。TNF-α作为一种具有抗肿瘤细胞因子,在抑制肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用。IL-6和TNF-α是促进肝癌发生发展的两种重要炎症介质。致癌剂DEN可诱导小鼠肝癌发生,IL-6基因敲除小鼠中DEN诱导肝癌的发生率、肿瘤数量和大小显著降低,IL-6和TNF-α可分别激活肿瘤细胞内NF-kβ和STAT3信号通路,导致肿瘤增殖、抗凋亡、血管生成、侵袭和转移相关基因的表达,使肝癌得以发生发展。Th17分泌的细胞因子除了IL-17(IL-17A)外,还包括IL-17F,以及IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α等细胞因子,Th17细胞被认为是一群重要的介导炎症反应的重要细胞还能激活树突状细胞和T淋巴辅助细胞,释放细胞因子维持慢性炎症状态和致癌变环境。IL-17是一种重要的炎症介质,它可以通过诱导其他炎症细胞因子如IL-6, TNF-α,及趋化因子如MCP-1、MIP-2等的表达,介导炎症细胞到局部的浸润及组织损伤。白细胞介素27(Interleukine27,IL-27)是2002年发现并命名的一种新的细胞因子,它与IL-12以及另一种新发现的细胞因子IL-23共同组成IL-12分子家族,具有复杂的生物学功能,在抗感染免疫,抗肿瘤免疫以及自身免疫病中发挥重要作用。基于已有的研究对HTATIP2/TIP30及炎症细胞因子与肿瘤及肝癌的各种相关报道,HTATIP2/TIP30基因的下调可能与原发性肝癌的发生有关。因此,该蛋白是否能够通过血清血检测,其表达水平与肝癌的发生、发展是否相关方面的研究显得非常必要和关键。此外,结合已有的AFP的临床价值,对HTATIP2/TIP30和AFP的肝癌的临床资料的相关性进行评估也显得很有意义,这样更有利于系统地分析和检验二者的检验效能,本研究拟通过运用Luminex xMAP技术检测,一次性对52例肝癌患者血清中的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、 IL-27、TNF-α等细胞因子进行检测,进一步探讨这些炎症细胞因子预测肝癌转移可能。以便更好地对其进行利用,这也是本研究的目的所在。2.实验方法：2.1患者选择选择2013年9月和2013年12月来医院就诊的肝癌病人和健康体检者,肝癌患者条件为：未经过任何治疗经病理为肝细胞癌的患者。共有84名受试者参与,并分别分为对照组：共包括32名健康体检人(无肝癌或其他肿瘤及明确诊断的疾病),男18例,女14例。在对照组中年龄范围为21-72岁(平均年龄43±15岁)；肝癌组：共52例,男45例,女7例,肝癌患者年龄范围为27至80岁(平均年龄54±12岁),HBV感染率(76.9%),平均肿瘤大小为5.6±4.9厘米,各入组人员在入院后进行相应治疗之前完成相应的CT、超声、血生化常规、凝血功能、血清学乙肝病毒定性和定量检测。2.2标本收集入院后征得患者知情同意,嘱患者晨起空腹,实验人员应用一次性真空采血管采外周静脉血约2ml,4摄氏度下4,000rpm离心10分钟,得到血清,共留取84例外周静脉血清。将血清置于-80摄氏度超低温冰箱中冷冻保存,备用,直至生化测定。2.3酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay)根据HTATIP2TIP30ELISA试剂盒(Cusabio Biotech.)说明书方法,检测肝癌组与对照组血清中HTATIP2TIP30的浓度,最低检出量0.16ng/ml。批内精密度(化验内精度)为CV%<8%,批间精密度(检测精度之间)的CV%<10%。2.4Roche电化学发光法测定HBeAg状态所有入组实验对象通过电化学发光法测定HBeAg,按照罗氏化学发光法检测HBeAg的SOP流程进行样本处理、上机、Elecsys软件分析判定该标本HBeAg阴、阳性。2.5荧光定量PCR测定血清HBV DNA水平所有入组实验对象按HBV荧光定量检测试剂盒说明书进行操作,将实验对象血清与PCR反应液充分混匀,与HBV定量标准品共同进行PCR扩增,待扩增结束后通过ABI7100进行数据分析。2.6Luminex xMAP检测肝癌患者血清中细胞因子Luminex xMAP技术(multi-anlyte profiling beads)eBioscience的ProcartaPlex试剂盒,细胞因子标准品(包括IL-1β,IL-10, IL-6, IL-17, TNF-α, IL-27)共6种细胞因子的标准品及样品稀释液。数据结果通过分析软件Luminex200分析,通过检测待测样品捕捉图像,继而经过分析图像,绘制标准曲线,计算得出待测样品的数据。2.7统计学方法SPSS17.0计算机程序软件包进行统计计算。结果以均数±标准差(SD)。单因素方差分析,组间多重比较选择LSD和SNK两两之间的多重比较分析对照组和肝癌组,及肝癌I-Ⅱ,Ⅲ-Ⅳ期均值。(Operating Characteristic curve) ROC受试者诊断特征曲线分析各指标对肝癌与正常组,肝癌转移组和无转移组、早期肝癌与正常组的诊断效能。Pearson相关分析(正态分布资料),Spearman(非正态分布资料)临床检测指标与细胞因子及生化指标的相关性。二元logistic回归分析和建立联合指标的诊断模型,Hosrner-Lemeshow进行logistic回归拟合优度检验,P值精确到小数点后3位,以P<0.05为有统计学差异。Medcalc绘制ROC曲线,Graphpade Prism5绘制柱状图及相关线图。3结果：3.1肝癌组与正常组及各期肝癌组血清HTATIP2/TIP30的水平HTATIP2/TIP30在肝癌组中浓度明显低于正常组分别为4.51±2.64和9.50±2.04(P<0.001),且Ⅰ-Ⅱ和Ⅲ-Ⅳ期浓度分别为4.22±1.98和3.02±1.80,结果显示Ⅲ-Ⅳ期较Ⅰ-Ⅱ期也降低,且差异有统计学意义(P<0.001)。3.2ROC曲线分析HTATIP2/TIP30与AFP诊断肝癌通过受试者诊断特征曲线(Receive Operating Characteristic)ROC曲线分析,HTATIP2/TIP30和AFP诊断肝癌和正常对照组的诊断效能,两指标的曲线下面积分别为0.928(P<0.001)和0.884(P<0.001),认为两指标诊断肝癌均有统计学意义。HTATIP2/TIP30截断点为7.271ng/ml时,诊断肝癌的敏感度84.6%,特异度93.7%,约登指数最大。3.3ROC曲线分析HTATIP2/TIP30与AFP诊断早期肝癌ROC分析HTATIP2/TIP30与AFP预测肝癌早期患者与正常对照组。HTATIP2/TIP30曲线面积AUC为0.789(0.789±0.069,P<0.001),敏感度88.2%,特异度50%；AFP曲线面积AUC为0.858(0.858±0.055,P<0.001),敏感度94.1%,特异度59.4%,两者诊断肝癌均有统计学意义,AFP对于早期肝癌的诊断效能稍优于HTATIP2/TIP30。3.4ROC曲线分析HTATIP2/TIP30与AFP诊断肝癌转移ROC分析HTATIP2/TIP30和AFP诊断肝癌转移,其对应的曲线下面积分别为(0.804,P<0.001)和(0.513,P=0.581),HTATIP2/TIP30作为诊断肝癌转移有统计学意义。HTATIP2/TIP30约登指数最大时的截断点为5.367ng/ml,其对应的预测肝癌转移的敏感度为91.7%,特异度为57.1%。而AFP(P=0.081)对于预测肝癌组转移无统计学意义。HTATIP2/TIP30对预测肝癌转移的诊断效能高于AFP, HTATIP2/TIP30可能成为肝癌转移的标志物。3.5HTATIP2/TIP30水平与临床指标的Spearman相关性分析HTATIP2/TIP30与乙肝病毒DNA和Child-Pugh评分呈负相关,相关系数和P值分别为(r=-0.364, P=0.002;)(r=-0.419, P=0.008;),相关有统计学意义,但是与乙肝病毒DNA相关不密切。与肿瘤最大径和AFP、粒细胞和淋巴细胞比值(NLR)在本研究中相关没有统计学意义。3.6HTATIP2/TIP30、HBvDNA水平、AFP三指标的Logistic逐步回归模型通过HTATIP2/TIP30、HBvDNA水平、AFP浓度3个因素做logistic向后逐步回归分析,选择进入变量的概率标准为0.10,剔除变量的概率标准为0.15,应变量“0”为正常对照,“1”为肝癌,得出回归方程：P=1[1+e-(4.449-0.717×1+0.042×2)]其中x1代表HTATIP2/TIP30, x2代表AFP, p为logistic模型预测概率,取值范围在0-1之间,e为自然对数(e=2.718),Odd Ratio (OR)值分别为：0.488和1.043；95%CI(95%可信区间)分别为(0.331-0.791)和(0.998-1.089)。回归方程提示HTATIP2/TIP30与AFP都是肝癌发生的独立影响因素,HTATIP2/TIP30为保护性因素,即HTATIP2/TIP30血清水平高的患者其患肝癌的风险为水平低的患者的0.488倍。AFP为危险因素,即AFP血清水平高的患者其患肝癌的风险为水平低的患者的1.043倍。两者回归模型PRE预测肝癌发生的曲线下面积(AUC)为0.963±0.020(P<0.001),其约登指数最大时对应的敏感度90.6%,特异度90.4%,均较两指单独标诊断时显著增高。3.7肝癌组血清多个细胞因子的检测运用Luminex xMAP方法检测肝癌转移与无转移组中血清标本中(IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α,IL-27)6个细胞因子的含量,结果显示无转移组中的各细胞因子含量分别为(IL-1β,3.93±2.07; IL-6,6.61±4.63; IL-10,7.77±5.49; IL-17A,2.67±2.53; IL-27,255.49±94.33),转移组的各组细胞因子含量为(IL-1β,4.11±1.95; IL-6,6.30±5.39; IL-10,8.70±4.77; IL-17A,5.56±2.85; IL-27,353.19±177.55),其中IL-17A, IL-27两组细胞因子在转移组浓度明显增高,P值分别为(0.015,P<0.001),差异有统计学意义。3.8HTATIP2ATIP30水平与血清各细胞因子Pearson相关性分析Pearson相关性分析HTATIP2/TIP30、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-27、 TNF-α等细胞因子相关性发现,IL-17与TIP30存在负相关(r=-0.601,P<0.001),两者相关较为密切,且相关有统计学意义。3.9ROC分析IL-17和IL-27预测肝癌转移能力ROC分析IL-17与IL-27两指标对肝癌的转移与无转移组,曲线下面积为分别为(0.818,P=0.044)和(0.664,P<0.001),两者作为指标预测肝癌转移均有统计学意义。IL-27预测肝癌转移的效能较IL-17更好。以IL-27为238.95pg/mL临界值时,敏感度为：95.8%,特异度为：64.3%,约登指数最大。IL-17选择临界值为2.005pg/ml,约登指数最大,其敏感度为83.3%,特异度35.7%。3.10logistic回归模型预测肝癌转移选择HTATIP2/TIP30、IL-27做logistic向后逐步回归分析,因变量选择“0”为无转移,“1”为转移。选择进入变量的概率标准为0.10,剔除变量的概率标准为0.15,得出回归方程：P=1[1+e-(-1.264-0.642×1+0.013x2)]其中x1代表HTATIP2/TIP30,×2代表IL-27,P为logistic模型预测概率,取值范围在0-1之间,e为自然对数(e=2.718), Odd Ratio (OR)值分别为：0.526和1.013；95%CI(95%可信区间)分别为(0.346-0.799)和(1.003-1.026)。这一回归方程提示HTATIP2/TIP30与IL-27都是肝癌转移的独立影响因素,HTATIP2/TIP30为保护性因素,HTATIP2/TIP30血清水平高的患者其转移的风险为水平低的患者的转移风险的0.526倍。IL-27为危险因素,IL-27血清水平高的患者其转移的风险为水平低的患者转移风险的1.013倍。两者回归模型PRE预测肝癌转移的曲线下面积(AUC)为0.903±0.043,P<0.001,敏感度87.5%,特异度82.1%,较两指标单独预测时明显增高.4结论：4.1血清中肝癌组HTATIP2/TIP30的水平显著低于正常对照组,且Ⅲ-Ⅳ期水平较Ⅰ-Ⅱ更加降低,差异有统计意义。4.2ROC分析HTATIP2/TIP30与AFP诊断各期肝癌组与对照组时,曲线下面积(AUC)较AFP高,敏感度和特异度均较AFP高。诊断早期肝癌时,其曲线下面积(AUC)稍小于AFP。对转移与无转移组的预测时,HTATIP2/TIP30明显优于AFP。提示HTATIP2/TIP30不仅是个可以诊断肝癌的指标,同时也是一个较好的预测肝癌转移的指标。4.3Spearman相关分析发现HTATIP2/TIP30水平与乙肝病毒DNA浓度和Child-Pugh分数呈负相关,有统计学意义,但与乙肝病毒DNA浓度相关不太密切。4.4通过Logistic逐步回归得出的HTATIP2/TIP30和AFP回归模型,回归方程提示HTATIP2/TIP30与AFP都是肝癌发生的独立影响因素HTATIP2/TIP30为保护性因素,即HTATIP2/TIP30血清水平高的患者其转移的风险为水平低的患者转移风险的0.488倍。AFP为危险因素,即AFP血清水平高的患者其转移的风险为水平低的患者转移风险的1.043倍。两者回归模型PRE预测肝癌发生的曲线下面积(AUC)为0.963±0.020(P<0.001)、其约登指数最大时对应的特异度90.6%,特异度90.4%均较两指单独标诊断时显著增高。4.5肝癌组转移与无转移组中的IL-17和IL-27较转移组明显增高,通过Pearson相关分析发现IL-17与HTATIP2/TIP30呈负相关,相关较为密切,相关有统计学意义。4.6ROC分析IL-27和IL-17预测肝癌转移,曲线下面积(AUC)较IL-17高,敏感度和特异度均较IL-17高。我们发现了新的指标IL-27能较好的预测肝癌转移。4.7通过Logistic逐步回归得出的HTATIP2/TIP30和IL-27回归模型,回归方程提示HTATIP2/TIP30与IL-27都是肝癌转移的独立影响因素,HTATIP2/TIP30为保护性因素,即HTATIP2/TIP30血清水平高的患者其转移的风险为水平低的患者转移风险的0.526倍,IL-27为危险因素,即IL-27血清水平高的患者其转移的风险为水平低的患者转移风险的1.013倍。两者回归模型PRE预测肝癌转移的曲线下面积(AUC)、敏感度和特异度均较两指标单独预测时明显增高。创新之处：1.本研究首次在肝癌患者的血清中检HTATIP2/TIP30水平,并发现其能成为诊断肝癌和预测转移的指标。2.首次通过液相芯片发现IL-17和IL-27与肝癌转移相关,两指标可联合用于肝癌转移的预测。