背景:药物性肝损伤（drug induced liver injury）是临床常见的肝脏疾病,其中对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）是最常见引起肝损伤的药物。其发病机制主要涉及线粒体功能障碍、氧化应激、APAP活性代谢产物的形成等,其中线粒体功能障碍可加速APAP肝损伤的进展。有研究表明衔接蛋白p66shc（Adaptor protein p66shc,p66shc）与氧化应激、线粒体形态改变密切相关。鼠尾草酸（Carnosic acid,CA）是一种从迷迭香中提取的多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗脂质堆积及抗凋亡等作用。已有文献证实多酚类化合物通过调控p66shc缓解肠缺血再灌注引起的小鼠肺及肝脏损伤。但p66shc是否在APAP诱导的肝损伤中起重要作用,以及CA是否可以通过作用于p66shc信号通路缓解APAP诱导的肝损伤,未见报道。目的:研究p66shc在APAP肝损伤中的作用;探讨CA通过调节p66shc信号通路对APAP所致肝损伤的保护作用机制。方法:1、鼠尾草酸对对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤的保护作用研究将50只健康成年的雄性C57BL小鼠（20±2g）随机分为以下5组:空白对照组;鼠尾草酸正常给药组（60mg/kg/d）;对乙酰氨基酚损伤组;对乙酰氨基酚+低剂量鼠尾草酸给药组（30mg/kg/d）;对乙酰氨基酚+高剂量鼠尾草酸给药组（60mg/kg/d）。灌胃给药,每天一次,连续4天给予鼠尾草酸,最后一天给予鼠尾草酸2h后,对乙酰氨基酚组、对乙酰氨基+低剂量鼠尾草酸给药组（30mg/kg/d）、对乙酰氨基酚+高剂量鼠尾草酸给药组（60mg/kg/d）,灌胃给予小鼠对乙酰氨基酚,剂量为300mg/kg。空白对照组、鼠尾草酸正常给药组（60mg/kg/d）给予同体积的三蒸水。24h后处死,收集血液标本,分离小鼠肝脏组织,于-80℃冰箱保存备用。按照试剂盒说明的操作步骤,检测血清中谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase,ALT）的活性、肝脏匀浆组织中的谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的活性。采用苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色检查肝脏病理改变。原位末端标记（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）染色法测定肝脏组织肝细胞的凋亡情况。Western Blot法检测肝组织中p66shc、Cleaved caspase-3、SOD-2、促凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）等蛋白表达水平。2、p66shc在对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝细胞（Aml-12）损伤中的作用（1）Aml-12细胞中APAP造模浓度的筛选Aml-12细胞随机分为5组:空白对照组（control）;APAP损伤组（2.5m M、5m M、10m M、20m M）。不同浓度的APAP诱导24h后,CCK8法测定细胞存活率。（2）p66shc在APAP诱导的Aml-12细胞损伤中的作用Aml-12细胞随机分为4组:空白对照组（control）;p66shc RNAi组;APAP组;APAP+p66shc RNAi组。转染结束后,加入APAP（10m M）诱导24h。Western Blot法检测细胞内p66shc、SOD-2、AIF等蛋白表达水平,JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位,荧光探针法测定细胞中活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）水平,透射电镜观测线粒体形态。（3）p66shc对Aml-12细胞线粒体形态的影响Aml-12细胞随机分为4组:空白转染组（pc DNA）;pc DNA-p66shc组;pc DNA-p66shc+抗氧化剂（N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）（3m M））组;pc DNA-p66shc+抗氧化酶（过氧化氢酶（Catalase,CAT）（1m M））组。转染pc DNA-p66shc 48h后,加入NAC、CAT继续作用1h。Western Blot法检测细胞内p66shc、AIF、SOD-2等蛋白表达水平,透射电镜检测线粒体形态。3、鼠尾草酸对APAP诱导的Aml-12细胞损伤的保护作用及机制（1）Aml-12细胞中鼠尾草酸浓度的筛选Aml-12细胞随机分为7组:空白对照组（control）;APAP损伤组（终浓度10m M）;5个剂量CA预处理组（1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）。CA与细胞共同孵育6h后,用APAP诱导24h,CCK8法测定细胞存活率。（2）鼠尾草酸作用于p66shc减轻APAP诱导的Aml-12细胞损伤Aml-12细胞随机分为5组:阴性对照组（si-control）;阴性对照（si-control）+APAP组;阴性对照组（si-control）+APAP+CA（10μM）组;p66shc RNAi+APAP组;p66shc RNAi+APAP+CA（10μM）组。转染后,CA与细胞共同孵育6h,加入APAP诱导24h,提取细胞蛋白。Western Blot法检测细胞内p66shc、SOD-2、AIF等蛋白表达情况。（3）鼠尾草酸抑制p66shc的易位减轻APAP诱导的Aml-12细胞损伤Aml-12细胞随机分为4组:空白对照组（control）;空白对照（control）+CA组;APAP组;APAP+CA组。给予CA作用6h,APAP诱导24h,提取细胞蛋白。Western Blot法检测线粒体及胞浆中p66shc蛋白表达水平。结果:APAP灌胃24h后小鼠出现急性肝损伤,表现在:（1）血清中转氨酶ALT、AST活性显著升高。（2）肝脏组织病理损伤水平明显,肝索排列杂乱,肝细胞大面积出血、变性、坏死,出现气球样变和炎症细胞浸润,同时肝组织细胞出现凋亡现象。（3）肝组织匀浆中GSH含量降低、SOD活性下降、MDA含量增加。表明APAP可导致GSH耗竭及氧化应激现象的发生。而给予CA预处理可减轻APAP的损伤作用,与APAP组相比,CA预处理组血清中ALT、AST活性明显降低,肝组织匀浆中GSH含量明显增高,SOD活性增加,MDA含量下降。CA对正常小鼠无毒性反应,表现在CA正常给药组肝功与空白对照组无明显差异,肝脏组织形态正常,未见脂质过氧化反应及损伤。给予CA预处理的APAP损伤组,小鼠的抗氧化能力显著提高,肝匀浆中GSH含量增强,SOD活性增加,MDA活性降低。APAP诱导Aml-12细胞损伤时,特异性敲减p66shc抑制AIF蛋白表达,同时SOD-2蛋白表达增加,线粒体膜电位升高、ROS含量减少,线粒体肿胀减轻。与此相反,过表达p66shc后,AIF的蛋白表达增加,SOD-2的蛋白表达下降,线粒体肿胀现象加剧。而给予NAC和CAT后,可缓解该病理损伤。说明p66shc在APAP诱导的肝细胞损伤中发挥重要的作用。CA显著下调p66shc的蛋白表达。同时抑制了p66shc的线粒体易位。结论:1、p66shc在APAP诱导的肝损伤中发挥重要的作用。2、鼠尾草酸通过调节p66shc信号,发挥对APAP肝损伤的保护作用。