大米镉含量分析及镉结合蛋白的分离纯化

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大米是我国人们生活中的重要主食食品,对人体能够产生严重危害的重金属镉是国家有毒污染物卫生标准—大米中的主要无机污染物限量指标。我国市售的大米重金属镉污染较严重,据抽样调查,目前市场上大米镉超标率高达10.3%。已有研究发现镉的毒性与其化学形态结构密切相关,因此研究大米中镉的存在形态具有现实意义。本文通过分析石墨炉原子吸收光谱法的检测限、精密度和加标回收率,明确该方法测定大米镉的可行性,并采用该方法分析不同品种、产地、加工程度的武汉市售品牌大米镉含量及淘洗、加工精度对大米镉含量的影响;以镉含量较高的大米为原料,采用碱法、热变性和乙醇沉淀提取分离大米镉结合蛋白,凝胶色谱、SDS-PAGE纯化出纯度均一的大米镉结合蛋白,及氨基酸自动分析仪、FTIR分析其氨基酸组成和二级结构,探讨大米镉结合蛋白的形成机理,拟为大米中镉的吸收和转化以及减少镉对人体的损伤奠定理论基础。研究结果如下:(1)石墨炉原子吸收光谱法测定大米镉含量,该方法测定结果线性关系良好,检出限为6.89ng/kg,加标回收率96.82%,精密度和准确性良好。粳米镉含量高于糯米,籼米镉含量高于粳米;湖南、湖北、江西等地区的大米镉含量较高,东北大米镉含量则普遍较低;糙米镉含量高于精米。大米在淘洗前后镉含量略有降低,但变化不显著。随加工精度增加,大米镉含量依次降低,糙米、三级大米、二级大米、一级大米的镉含量依次减少,糙米和一级大米镉含量差异显著。(2)采用碱法提取大米蛋白(AP),热变性处理AP得热变性蛋白(TP),AP经热变性蛋白质损失为9.63%、镉损失1.44%,乙醇沉淀TP得乙醇沉淀蛋白(EP),TP经乙醇沉淀蛋白质损失14.16%,镉损失39.40%,大米镉结合蛋白主要存在于EP中,大米经碱提、热变性和乙醇沉淀处理得到了大米镉结合蛋白粗品。AP、TP、EP均在波长210nm处有最大吸收峰。AP、TP、EP中带电荷氨基酸含量占43%以上,疏水性氨基酸约占30%,芳香族氨基酸占10%左右,含硫氨基酸约占5%。AP分子质量的范围为94KDa、50KDa、32KDa、16KDa和14KDa,TP分子质量的范围为50KDa、32KDa、16KDa和14KDa,EP分子质量的范围为32KDa和16KDa。AP中N-H相对于C=O只以反式构型形式存在,TP和EP中N-H相对于C=O主要以反式构型形式存在。AP的二级结构主要为α-螺旋和β-转角,有少量β-折叠;TP的二级结构只含有β-折叠和β-转角,且以β-折叠为主;EP的二级结构主要为β-折叠和β-转角,还含有少量α-螺旋和无规卷曲。EP的670cm-1谱峰较AP、TP增加,AP与TP之间无明显变化。(3)采用葡聚糖凝胶G-75纯化EP,分离色谱条件:洗脱液为NaHCO3-NaOH(pH9.8)缓冲体系、洗脱速度为0.8mL/min、检测波长为210nm,收集得到两个组分,即组分a和组分b。组分a和组分b中,每克蛋白质中含有的镉质量分别为157.73ng和2165.93ng,组分b中每克蛋白质中含有的镉质量是组分a的13.7倍,组分b的持镉能力远高于组分a,所以组分b是目标大米镉结合蛋白。经SDS-PAGE鉴定,组分b为单一的组分,分子质量约为32KDa。组分b中N-H相对于C=O以反式构型存在,二级结构只含有β-折叠和β-转角,有-CH3和-CH2基团中的C-H伸缩振动和-NH2平面外变形。组分b中疏水性氨基酸占56.76%、芳香族氨基酸占19.41%,是一类富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的镉结合蛋白。
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