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目的:贲门腺癌(gastric cardiac adenocarcinoma, GCA)是食管胃交界癌的一种类型,为我国特别是北方地区常见的消化道恶性肿瘤之一。流行病学调查发现,在高发区贲门腺癌的发病率和死亡率有逐年上升的趋势。其与食管癌在临床症状和地域分布上具有相似的流行病学特征,并且贲门腺癌早期不易发现,临床就诊病例多为中晚期,治疗效果较差,所以对贲门腺癌的发病机制和早期诊断的研究显得尤为重要。目前贲门腺癌的发生、发展的分子机制尚不十分清楚,一般认为,贲门腺癌的发生是环境和遗传因素共同作用的结果。为降低贲门腺癌的发病率和死亡率就要对其发病机制进行研究。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kniase,MAPK)信号转导通路的天然抑制剂,广泛存在于各种生物中,参与了对细胞内多种信号转导通路的调节作用,其表达降低与多种肿瘤的发生、发展和转移有关。针对RKIP基因异常表达机制的研究,除传统意义上导致疾病发生的遗传学机制外,近年来以DNA甲基化为代表的表观遗传学改变已经成为研究肿瘤发病机制的一个热点而受到广泛关注。但是,RKIP基因启动子区甲基化导致其异常表达的研究较多针对胃癌、结直肠癌等疾病,对贲门腺癌的研究在国内外尚未见报道。因此深入研究RKIP基因启动子区甲基化在引发贲门腺癌中的作用,将会为揭示贲门腺癌的发病机制提供分子生物学依据。本课题研究以河北省食管癌高发区贲门腺癌为研究对象,运用甲基化特异性PCR(MSP)检测RKIP基因甲基化状态与贲门腺癌发生,浸润和转移的关系,并结合免疫组织化学和RT-PCR的方法检测了在贲门腺癌组织和癌旁非肿瘤组织中RKIP的蛋白与mRNA表达情况及其表达与各临床指标及生物学行为的关系,探讨该基因甲基化在贲门腺癌发生、发展、浸润、转移中的作用,从而为揭示贲门腺癌发病的分子水平机制,基因治疗及临床预后等方面提供新的理论和试验依据。方法:1采用改进的甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR, MSP)技术检测80例贲门腺癌组织及51例癌旁非肿瘤组织中RKIP基因启动子区的甲基化状态。2采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR, RT-PCR)技术检测28例贲门腺癌组织及24例癌旁非肿瘤组织中RKIP基因mRNA的表达水平。3免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)S-P法检测32例贲门腺癌组织,32例癌旁非肿瘤组织中RKIP基因的蛋白表达情况。4运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学分析。结果:1 RKIP基因在贲门腺癌和癌旁非肿瘤组织中的甲基化发生率分别为65%(52/80)和33.3%(17/51),差异有统计学意义,贲门腺癌组的甲基化发生率显著高于癌旁非肿瘤组(P<0.001);在贲门腺癌组织中,Ⅲ、Ⅳ期甲基化率31/45(68.9%)高于Ⅰ、Ⅱ期甲基化率21/35(60%),高中分化组甲基化率35/52(67.3%)高于低分化组甲基化发生率17/28(60.7%),但其差异均无统计学意义(P>0.05)。RKIP基因与各临床资料如年龄、性别有无淋巴结转移、肿瘤分化程度及TNM分期均无关(P>0.05)。2 RKIP在贲门腺癌组及癌旁非肿瘤组中的蛋白表达率分别为43.8%(14/32)和75%(24/32),差异有统计学意义,贲门腺癌组的表达率明显低于癌旁非肿瘤组(P<0.05);在贲门腺癌组织中,Ⅲ、Ⅳ期患者的蛋白表达率12/26 (46.2%)高于Ⅰ、Ⅱ期患者的蛋白表达率2/6(3.3%),低分化腺癌组的蛋白表达率5/13(38.5%)低于高中分化腺癌组蛋白表达率9/19(47.4%),RKIP的蛋白表达与各临床资料如患者年龄、性别分组无关(P>0.05),与淋巴结转移、肿瘤临床分期、病理学分期亦无关(P>0.05)。3 RKIP基因mRNA在贲门腺癌组织、癌旁非肿瘤组织中的相对表达量分别为0.67±0.41和3.46±1.76,贲门腺癌组表达量显著低于癌旁非肿瘤组,差异有统计学意义(P<0.05)。在贲门腺癌组织中,RKIP基因mRNA表达与各临床资料如患者年龄、性别分组无关(P>0.05),与淋巴结转移、肿瘤临床分期、病理学分期亦无关(P>0.05)。4 RKIP基因启动子区甲基化与mRNA表达之间的关系:贲门腺癌组织RKIP基因甲基化阳性其mRNA表达量(0.73±0.43)相比较该基因甲基化阴性贲门腺癌组织mRNA表达量(0.42±0.35)高,但差异无统计学意义(P>0.05)。5 RKIP基因启动子区甲基化与蛋白表达之间的关系:贲门腺癌组织RKIP基因甲基化阳性蛋白表达阳性率为47.06%(8∕17),该基因甲基化阴性中蛋白表达阳性率为57.14%(4/7),贲门腺癌组织甲基化阳性RKIP基因蛋白表达较甲基化阴性RKIP基因蛋白表达低,差异无统计学意义(P>0.05)。6 RKIP基因蛋白表达与mRNA表达之间的关系:贲门腺癌组织RKIP基因蛋白表达阳性其mRNA表达量为0.65±0.47,贲门腺癌该基因蛋白表达阴性其mRNA表达量为0.65±0.43,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1 RKIP基因在贲门腺癌组的甲基化发生率显著高于癌旁非肿瘤组织中的甲基化发生率,但RKIP基因甲基化与临床资料无关,提示RKIP基因启动子甲基化可能与贲门腺癌的发生有关,而与其发展无关。同时,RKIP在贲门腺癌组织中的蛋白和mRNA表达量明显低于癌旁非肿瘤组织,提示RKIP的异常表达可能与贲门腺癌的发生有关。2 RKIP基因蛋白相对表达量在甲基化阳性的贲门腺癌组织与甲基化阴性的贲门腺癌组织中差异无统计学意义,且RKIP基因蛋白相对表达量与临床资料无关,提示甲基化可能不是导致RKIP蛋白表达异常的主要原因。3 RKIP基因mRNA相对表达量在甲基化阳性的贲门腺癌组织与甲基化阴性的贲门腺癌组织中差异无统计学意义,且RKIP基因的mRNA相对表达量与临床资料无关,提示甲基化可能不是导致RKIP基因mRNA表达异常的主要原因。