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猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),属于冠状病毒科冠状病毒属,是一种急性高度接触性肠道传染病,能够引起各年龄段的猪产生严重的呕吐、脱水和腹泻。TGEV经常会对大规模的哺乳猪造成巨大的经济损失。S蛋白是TGEV冠状病毒关键的结构蛋白,S蛋白是I型跨膜蛋白位于病毒的表面,对于介导病毒粒子结合特异性的细胞受体是有作用的。S蛋白有四个抗原表位A,B,C和D,位于S蛋白N末端附近,其中编码抗原位点的A和D区域这里定义为SAD,SAD是最具有诱导中和抗体产生的区域。因此,对该段基因的研究,在猪传染性胃肠炎病毒的抗病毒研究领域中具有重要价值。在本次研究中,我们从TGEV中克隆SAD基因,通过双酶切连接转化成功构建pET-30a-SAD质粒,将包含SAD(1102 bp-1812 bp)基因片段的重组质粒转进E.coli BL21中,在37℃温箱中培养过夜,阳性的菌液在大肠杆菌中经过37℃摇床培养7h,经IPTG诱导后获得大量表达的SAD蛋白,表达的产物用SDS-PAGE分析,该蛋白是大小为34k Da以包涵体形式存在的蛋白。将纯化的重组SAD蛋白免疫BALB/c小鼠,把骨髓瘤SP2/0细胞与免疫鼠脾细胞融合产生杂交瘤细胞。通过间接ELISA方法进行阳性克隆筛选,通过有限稀释的方法获得阳性克隆株进行扩大培养,最终获得针对猪传染性胃肠炎病毒SAD的单克隆抗体(MAb)2B10。应用免疫印迹实验(Western blot)和间接免疫荧光实验(IFA)可知,MAb 2B10能和TGEV SAD蛋白发生特异性反应而且免疫荧光显示单克隆抗体能检测到感染TGEV的细胞。通过抗体亚类检测,2B10株属于Ig G2b亚类、K链。在研究中获得的单克隆抗体能特异性的识别TGEV,而不与其他病毒反应。用纯化的腹水作为靶分子,按照随机噬菌体十二肽库操作指南进行4轮筛选,按照投入噬菌体的量一致,包被的抗体浓度逐渐减少,Tween-20的浓度逐渐增大的方法筛选出具有高亲和力的噬菌体克隆。对获得的28个噬菌体克隆进行ELISA结合实验,选出结合力最强的10个与TGEV SAD单克隆抗体特异性结合的噬菌体单克隆送去测序。获得含有5个不同的序列,将与病毒反应性最高的7号噬菌体(SGVYKVAYDWQH)和25号噬菌体(YTSSMLISSSLS)合成多肽,分别命名为P-S和P-Y,评价它的抗病毒能力。用实时荧光定量RT-PCR实验证实了P-S和P-Y对TGEV有抑制效果,并且多肽对病毒的抑制作用呈剂量依赖性,P-Y多肽的抑制效果更好。