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目的高温热浪对心血管系统疾病发病率、死亡率影响明显,因此,防治热应激对人对心血管疾病的影响具有重要意义。而动脉粥样硬化为心血管疾病的基本病理基础,因此本研究应用气候环境模拟技术,比较小鼠在热环境下主动脉粥样硬化斑块和HSP70、TLR4、MyD88、NF-κB基因表达水平和蛋白表达量,研究热环境应激对动脉粥样硬化小鼠病变程度的影响,探讨HSP70和TLR4信号通路在热应激对动脉粥样硬化的影响中发挥的作用机制。另外观察王氏清暑益气汤干预后上述指标的变化,反证上述机制,为中医药防治高温热浪下心脑血管疾病提供实验依据。方法1 不同热应激模式对小鼠的影响及中医药干预疗效观察1.1观察不同上升速度的高温对小鼠死亡率的影响:将16只昆明小鼠随机分为2组:缓升组和骤升组,置入人工气候箱喂养,使两组受热速度一快一慢,观察记录两组小鼠的死亡数量、死亡时间,计算死亡率。1.2中药防治热应激对小鼠影响疗效观察:将40只SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为5组:空白组、高温组、王氏清暑益气汤组、生脉散组、石斛生脉散组。置入人工气候箱喂养,药物组给予相应药物灌胃,观察小鼠死亡率、血脂情况,从而选择防治效果最强的中药组。2热应激对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块及HSP70、TLR4信号通路的影响及王氏清暑益气汤的防治作用2.1探讨热应激对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块及HSP70、TLR4信号通路的影响:将16只SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白组、高温组,全程普通饲料喂养;16只SPF级雄性ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠随机分为AS组、高温AS组,高脂饲料喂养。4组均置于普通环境饲养。12周造模结束后,空白组、AS组仍置于普通环境饲养。高温组、高温AS组置入人工气候箱喂养,使其接受热暴露,结束后,处死小鼠,采集标本,检测小鼠的肛温、内脏指数、动脉粥样硬化斑块大小、血脂四项,以及HSP70、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。2.2王氏清暑益气汤防治热应激对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化及HSP70、TLR4信号通路的疗效观察:将8只SPF级雄性C57BL/6J小鼠设为正常组,全程普通饲料喂养;40只ApoE-/-小鼠随机数字法分为模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组,全程高脂饲料喂养。造模11周后,正常组给予等剂量0.9%氯化钠溶液,全程普通环境、普通饲料喂养;模型组给予等剂量0.9%氯化钠溶液;高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予2g/ml、1g/ml王氏清暑益气汤灌胃1次/天,一周后除正常组外都置于人工气候箱喂养,使其接受热暴露,结束后,处死小鼠,采集标本,检测小鼠的肛温、内脏指数、动脉粥样硬化斑块大小、血脂四项,以及HSP70、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。结果1 不同热应激模式对小鼠的影响及中医药干预疗效观察1.1观察不同上升速度的高温对小鼠死亡率的影响:当气候箱温度为35℃和38℃时,96h内,缓升组和骤升组均无小鼠死亡,两组小鼠死亡率均为0%;当气候箱温度升高至40℃时,24h内骤升组死亡率为87.5%,缓升组小鼠死亡率为25%。1.2中药防治热应激对小鼠影响的疗效观察:死亡率:将小鼠放入35℃气候箱内72h,38℃气候箱内24h,各组小鼠死亡率均为0%。放入40℃气候箱,24h内空白组和王氏清暑益气汤组死亡率为0%,高温组死亡率为100%;三个药物治疗组死亡率均有所下降,其中王氏清暑益气汤组无小鼠死亡,生脉散组死亡率为42.9%;石斛生脉散组死亡率为14.3%。血脂:和空白组相比,高温组HDL-C明显降低（***P<0.001）;和高温组相比,生脉散组、王氏清暑益气汤组、石斛生脉散组HDL-C均明显升高（#P<0.05）。2热应激对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块及HSP70、TLR4信号通路的影响及王氏清暑益气汤的防治作用2.1探讨热应激对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块及HSP70、TLR4信号通路的影响:死亡率:气候箱温度为35℃和38℃时,各组均无小鼠死亡,死亡率均为0%。肛温:置于35℃气候箱72h后,和空白组相比,模型组小鼠肛温上升高度明显增高（***P<0.001）;和模型组相比,高剂量组和中剂量组肛温上升高度明显降低,其中高剂量组##P<0.01,中剂量组#P<0.05。当把小鼠继续放入38℃气候箱下24h后,和空白组相比,模型组小鼠肛温上升高度明显降低（**P<0.01）。体质量:12周造模结束后,和空白组相比,AS组和高温AS组的体质量显著升高,AS组*P<0.05,高温AS组**P<0.01;将小鼠放入气候箱实验后,和空白组相比,AS组小鼠体质量仍然显著升高（***P<0.001）。内脏指数:和空白组相比,AS组肝指数明显升高（***P<0.001）,高温组和高温AS组无明显差异;和AS组相比,高温AS组肝指数明显降低（#P<0.05）。油红0染色:和空白组相比,高温组C57BL/6J小鼠主动脉内膜无增厚、无斑块生成,AS组和高温AS组的ApoE-/-小鼠主动脉内膜均呈圆形弥漫性增厚,并形成典型的动脉粥样硬化斑块;和AS组相比,高温AS组内膜增厚更严重,且粥样硬化斑块和管腔的面积比明显增大（**P<0.01）。血脂:和空白组相比,高温组、AS组、高温AS组的甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇浓度上升,高密度脂蛋白胆固醇浓度和总胆固醇下降;和单纯高温组相比,高温AS组的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇浓度和高密度脂蛋白胆固醇浓度均上升;和AS组相比,高温AS组甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇浓度上升,高密度脂蛋白胆固醇浓度和总胆固醇显著下降。mRNA水平和蛋白表达量:和空白组相比,高温组、AS组、高温AS组的HSP70和TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平都有不同程度的上升,有统计学差异;和高温组相比,高温AS组的HSP70和TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平均明显升高,有统计学差异;和AS组相比,高温AS组HSP70和TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平均明显升高,有统计学差异。蛋白表达水平和mRNA水平结果趋势一致。2.2王氏清暑益气汤防治热应激对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化及HSP70、TLR4信号通路的疗效观察:死亡率:气候箱温度为35℃和38℃时,各组均无小鼠死亡,死亡率均为0%。肛温:置于35℃气候箱72h后,和空白组相比,高温组小鼠肛温上升高度明显增高（***P<0.001）;和高温组相比,高温AS组小鼠肛温变化无明显差异;和AS组相比,高温AS组小鼠肛温上升高度明显增高（ΔΔΔP<0.001）。当把小鼠继续放入38℃气候箱下24h后,和空白组相比,高温组小鼠肛温上升高度明显降低（***P<0.001）;和高温组相比,高温AS组小鼠肛温上升高度变化无明显差异;和AS组相比,高温AS组小鼠肛温上升高度明显降低（ΔΔP<0.01）。体脂量:12周造模结束后,和空白组比较,模型组和中剂量组、低剂量组体质量上升明显（**P<0.01）,高剂量组体脂量上升明显（*P<0.05）。油红O染色:和模型组相比,三个中药防治组均能减小斑块和血管腔的面积比（###P<0.001）。血脂:和空白组相比,模型组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇浓度、高密度脂蛋白胆固醇浓度均明显上升;和模型组相比,三个药物组的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇浓度、高密度脂蛋白胆固醇都有不同程度的下降。mRNA水平和蛋白表达量:和空白组相比,模型组的HSP70和TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平和都有不同程度的上升（***P<0.001）;和模型组相比,三个药物组的HSP70和TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平,明显下降（###P<0.001）。蛋白表达水平和mRNA水平结果趋势一致。结论1.热应激达到一定程度（如41℃）会提高小鼠死亡率和肛温,降低小鼠体质量。2.缓慢上升的热应激模式对小鼠死亡率的影响比快速上升的热应激模式小。3.生脉散、石斛生脉散和王氏清暑益气汤都能一定程度上缓解热应激对小鼠的死亡率和肛温的影响,其中,王氏清暑益气的效果最佳,石斛生脉散的次之,生脉散的作用效果较前两者稍差。4.热应激诱导过度表达的HSP70也可能会成为TLR4的配体,结合通过MyD88依赖或非依赖途径激活NF-κB,促使炎性因子的合成和释放,从而促进动脉粥样硬化斑块的破裂、血栓形成。5.王氏清暑益气汤能抑制过表达的HSP70,负性调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,降低炎症反应,防治高温对ApoE-/-小鼠心血管的损伤,减轻动脉粥样硬化,稳定ApoE-/-小鼠易损斑块和炎症状态。