【摘 要】
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肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition proteins,PGRPs）在昆虫中广泛存在,是一类非常重要的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）,它可以特异性的识别细菌细胞
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肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition proteins,PGRPs）在昆虫中广泛存在,是一类非常重要的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）,它可以特异性的识别细菌细胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan,PGN）,从而引发机体对外源微生物的免疫反应。PGRP在基因组中通常以家族形式存在,按照其5’-非翻译区和转录长短型将其分为L型PGRP和S型PGRP。果蝇（Drosophila melanogaster）作为模式昆虫,研究发现其体内有13条PGRP基因序列,分别参与先天免疫中的体液免疫和细胞免疫途径。家蚕（Bombyx mori）基因组测序完成后,Tanaka通过生物信息学分析预测在家蚕中存在12条BmPGRPs,其中6条S型6条L型,并预测BmPGRPs可能参与家蚕免疫,但大部分结构和功能还有待进一步研究。基于此,本实验拟以家蚕BmPGRP-S5为研究对象,将构建好的BmPGRP-S5重组载体转染至果蝇胚胎S2细胞,通过BT抗生素筛选获得稳定表达BmPGRP-S5蛋白的S2细胞系。大量培养S2细胞,将分泌表达的BmPGRP-S5蛋白通过Ni-NTA进行纯化,以便进行后续该蛋白功能的生物学研究,获得的主要研究成果如下:（1）通过转染,构建稳定表达BmPGRP-S5蛋白的S2-BmPGRP-S5细胞系,大量培养后,通过Ni-NTA亲和层析纯化BmPGRP-S5蛋白,并冻干备用。（2）BmPGRP-S5蛋白对大肠杆菌E.coli、金黄色葡萄球菌S.aureus、巨大芽孢杆菌B.megaterium的抑菌效果较弱,但是在Zn2+存在的情况下,BmPGRP-S5蛋白对B.megaterium的抑菌效果有明显的增强作用,而对E.coli和S.aureus依然没有抑菌效果。（3）将BmPGRP-S5蛋白与E.coli、S.aureus与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的胞壁组分进行结合实验。ELISA结果显示,BmPGRP-S5与S.aureus的Lys-PGN、Bacillus subtilis的LTA和E.coli的Dap-PGN的结合能力较强,但与S.aureus的LTA、E.coli的LPS和Bacillus subtilis的PGN的结合能力较弱。（4）通过BmPGRPs对家蚕血淋巴黑化反应的影响发现,BmPGRP-S5可以促进S.aureus胞壁组分PGN、Bacillus subtilis胞壁组分LTA对黑化的激活速度。（5）通过BmPGRP-S5蛋白对血细胞吞噬E.coli、S.aureus、B.megaterium的研究发现,BmPGRP-S5可以促进家蚕血细胞对E.coli和S.aureus的吞噬,但对B.megaterium的影响要小。研究结果表明,BmPGRP-S5可以通过识别细菌胞壁组分引发家蚕的黑化和细胞吞噬。作为分泌型蛋白,BmPGRP-S5主要参与对革兰氏阳性菌的识别。本研究将有助于阐明家蚕血细胞对外源微生物吞噬的识别机制,同时也为进一步寻找开发新的杀菌药物研究提供新的靶标参考。
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