论文部分内容阅读
糖基化是蛋白质翻译后最重要的修饰之一,通过影响蛋白质的折叠、降解及转运等调节蛋白质的生物学功能,异常糖基化在肿瘤细胞的扩散和侵袭、细胞与基质的相互作用、血管生成和免疫调节等过程中起关键作用。目前,糖蛋白的研究多集中在新型肿瘤分子靶标的发现及其生物学功能上,与之相关的糖基转移酶分子调控机制关注较少。唾液酸化修饰和核心岩藻糖化修饰是肿瘤发生发展过程中最重要的修饰,研究与之对应的糖基转移酶分子调控机制将有助于深入了解其在癌症发生发展中的作用,为癌症的治疗提供理论依据。课题组前期研究发现多聚唾液酸(polysialic acid,PSA)对神经粘附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM)的修饰可显著增强NCAM介导的细胞增殖和迁移,降低NCAM介导的细胞黏附。PSA是由ST8Sia II(STX)和ST8Sia IV(PST)两个唾液酸转移酶催化合成,通过基因芯片对小鼠乳腺上皮细胞NMuMG发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)前后糖基转移酶的表达差异分析,发现STX和PST在mRNA水平上倍性变化迥异。因此,阐明STX和PST分子调控机制,有助于理解多聚唾液酸及多聚唾液酸转移酶在肿瘤转移过程中的作用。miRNAs(Micro RNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,几乎参与了包括细胞发育、器官形成、细胞增殖和凋亡等所有生命活动。在癌症过程中往往伴有miRNA的异常表达,但miRNA影响糖基化进而在肿瘤恶性转化过程中发挥作用的相关研究甚少。本研究利用糖基因芯片分析了过表达miR-10b的MCF10A细胞中糖类相关基因的表达差异,发现miR-10b显著上调α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6-fucosyltransferase,FUT8)的表达,而FUT8可专一性地将GDP-岩藻糖转移至N-糖链核心结构形成核心岩藻糖,与恶性肿瘤的发生、发展有密切联系,因此,阐明miR-10b调控FUT8的分子机制,将为更好地理解miRNA的糖生物学功能并为乳腺癌的诊疗提供一定的理论基础。本研究分别以人和小鼠乳腺细胞和乳腺癌细胞为研究对象,阐明了EMT模型中唾液酸转移酶STX和PST差异表达的分子调控机制,分析过表达miR-10b对MCF10A细胞糖基转移酶和糖链的表达影响,着重阐明了miR-10b调控FUT8表达的分子机制。研究结果如下:(1)小鼠乳腺上皮细胞发生EMT过程中唾液酸转移酶STX和PST分子调控机制的研究。首先,通过RT-PCR验证了STX和PST的表达差异;其次,通过双荧光素酶报告实验和凝胶滞留实验等发现转录因子Pax3上调STX的表达,下调PST的表达;最后,Pax3显著增强NCAM和PSA-NCAM的表达,促进细胞迁移,但对细胞增殖无显著影响。(2)miR-10b对人正常乳腺上皮细胞MCF10A表达N-糖链及O-糖链的影响。首先,利用糖类相关基因芯片系统筛选了MCF10A细胞中受miR-10b调控显著的糖基转移酶;其次,分析了过表达miR-10b对细胞N-糖链和O-糖链表达的影响;最后,通过荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和凝集素免疫印迹验证了糖基转移酶FUT8、MGAT3及OGT及其对应糖链结构的表达。结果发现miR-10b通过改变糖基转移酶的表达对细胞内糖链表达产生全局的影响,尤为注意的是,miR-10b可以显著上调FUT8的表达。(3)miR-10b通过FUT8/AKT通路增强乳腺癌细胞的运动和增殖能力。首先,分别在MCF10A细胞中过表达FUT8和在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中干扰FUT8的表达,发现FUT8高表达能够显著提高细胞的运动和增殖能力。其次,抑制MCF10A/Twist细胞及TGF-β处理的MCF10A细胞中过表达的miR-10b,检测FUT8和p-AKT的表达变化及对细胞运动和增殖的影响,发现miR-10b促进FUT8的表达并激活AKT,增强细胞的运动和增殖能力。(4)miR-10b通过miR-10b/TFAP2C/STAT3通路调控乳腺癌细胞中FUT8的表达。首先,发现FUT8在乳腺癌中表达升高,并通过乳腺癌组织芯片免疫染色进行了验证;其次,生物信息学分析发现转录因子TFAP2C通过p-STAT3调节FUT8的表达;再次,分析TCGA数据库中1205个乳腺组织样本(包含正常乳腺组织112例,乳腺癌组织1903例),发现TFAP2C与FUT8在mRNA水平的表达呈负相关,并通过临床样本的免疫组化实验得到进一步验证;最后,通过双荧光素酶报告实验确认miR-10b可以抑制TFAP2C的表达。