论文部分内容阅读
人感染甲型H7N9流感病毒是少数几种能感染人的甲型流感病毒之一。当甲型H7N9流感疫情爆发时,常规的流感病毒检测方法因需要昂贵的大型检测仪器和高标准的检测环境而难以发挥作用,因此,迫切需要找到一种适用于现场检测的H7N9甲型流感病毒检测方法。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）-Cas13a蛋白质是一种经过密码子优化可由原核生物表达的蛋白质。当Cas13a通过单链引导RNA（crRNA）与靶RNA特异性结合时,其蛋白质构象发生改变并产生RNase活性,从而非特异性地降解RNA。利用Cas13a的特性,本文旨在建立一种潜在的H7N9病毒核酸现场检测方法。主要研究结果如下:1、对两种感受态大肠杆菌和两种培养基进行组合筛选,然后取大肠杆菌表达的可溶蛋白质进行SDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）,经考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析各蛋白质条带。单因素实验结果表明,使用LB（Luria-Bertan）培养基培养Rosetta 2（DE3）pLysS大肠杆菌表达LwCas13a蛋白质占总蛋白质比例最高达到8.27%。分别对影响大肠杆菌诱导表达的各种因素进行单因素优化,使用控制变量法改变诱导条件,然后对大肠杆菌表达的蛋白质进行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析各蛋白质条带。研究结果表明,在大肠杆菌指数生长期OD600值为1.0时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例最高,达到5.17%;加入0.1 mM IPTG（Isopropylβ-D-Thiogalactoside）时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例最高,达到5.97%;诱导温度设置为25℃时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例最高,达到7.43%;诱导16小时时,诱导表达的目的蛋白质占总蛋白质的比例达到最大为8.13%。使用亲和层析法纯化LwCas13a时,纯化效果较差,有许多杂蛋白质存在;使用酶切去亲和层析法纯化LwCas13a时,纯化效果很好,蛋白质进行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析纯度很高。2、设计两组阴性对照验证Cas13a蛋白质复合体的活性和特异性。研究结果表明,实验组测得荧光值显著高于两组阴性对照,证明Cas13a蛋白质复合体有RNase活性且针对靶RNA有良好的特异性。参考RNase A间接测量1 IU Cas13a蛋白质复合体,使用二分法测量各组分最适量。研究结果表明,1 IU Cas13a蛋白质复合体由1.875 pmol Cas13a,2.25 pmol crRNA和64.46 pmol靶RNA组成。在1 IU Cas13a蛋白质复合体的基础上稀释Cas13a蛋白质和crRNA以确定最佳使用量。研究结果表明,在20μL检测体系中,应有9.375 nM Cas13a和12.5 nM crRNA,另外加入1μL RNase抑制剂,100 ng人类总RNA,一定量的待检测RNA和300 nM RNA探针以构成检测体系。3、使用实时荧光定量的方法测定提取自H7N9病毒株样本中表达HA（hemagglutinin）和NA（nueraminidase）的RNA浓度。研究结果表明,表达HA RNA浓度为29.14 fM,表达NA RNA浓度为819.72 fM。分别使用该已知浓度样本和标准品RNA评估检测体系的最低检测限及最低检测时间。研究结果表明,该方法能在5 min内检测出1 nM的NA RNA。为提高检测灵敏度,RT-RPA和T7体外转录被引入以构建新的检测体系。针对HA和NA RNA分别设计了3组9对RPA引物,通过筛选确定SX-H3-F+SX-H1-R引物对和SX-N2-F+SX-N3-R引物对分别为针对HA和NA基因的最佳RPA引物。在下游引物5’端加上T7启动子序列并按照RPA试剂盒说明书构建新的检测体系,使用该已知浓度的H7N9 RNA样本评估检测体系的最低检测限及最低检测时间。研究结果表明,该方法能在30 min内检测出100 aM的NA RNA。使用新的检测体系对提取自各种亚型的甲型流感病毒RNA进行检测。检测结果表明,只有H7N9病毒组荧光值显著升高,证明新检测体系特异性良好。因此,我们诱导表达和纯化出了有活性的Cas13a蛋白质,并基于Cas13a蛋白质构建出了针对H7N9甲型流感病毒的具有良好灵敏度和特异性的检测体系。为实现H7N9甲型流感病毒现场检测提供了理论基础。