研究背景与意义:急性髓系白血病(AML)是获得性髓系细胞恶性增生引起的高度异质性的克隆性疾病,是成人最常见的急性白血病,约占成人白血病发病率的70%。近年来,随着化疗和支持疗法的不断发展,AML患者的治疗完全缓解率和长期生存率得到明显提高。但仍有20%-30%患者复发,5年总生存率仅为40%-50%。改善初治完全缓解率,克服缓解后复发,成为AML治疗的难点之一。时至今日,分子靶向治疗趋近成熟并已成为当下癌症治疗的主要手段之一,随着对AML分子生物学研究的深入,越来越多的异常基因和异常的信号传导通路被发现,这些基因和信号通路为临床肿瘤靶点治疗提供了广阔的思路和可能性,更加有助于新药或者新型疗法的开发与实践,对肿瘤临床医疗有着重要意义。非编码核糖核酸(non-coding RNA,ncRNA)曾被认为是细胞中的废弃物,不调控细胞增殖相关进程,但随着研究不断深入,ncRNA的功能被不断挖掘出来。非编码RNA以序列长度分类有长链非编码RNA(long-non-coding RNA),短链非编码RNA(short-non-coding RNA,snoRNA)微小非编码RNA(micro RNA,miRNA)。其中miRNA在近年来受到学界的广泛关注,其中在肿瘤方面miRNA的研究也越发深入,部分miRNA的表达会引起肿瘤的发生(onco miRNA),而有些miRNA表达则会抑制肿瘤生命进程(Tumor Suppressor miRNA)。这种对肿瘤正面或负面的作用机制大部分是靠miRNA调控相应蛋白表达而完成的。同时miRNA也受RNA酶等蛋白调控翻译剪切等过程。砷拮抗蛋白-2(Arsenic resistance protein 2,Ars2)是一种高度保守蛋白,研究表明Ars2与mRNA 5`端帽式结构复合物(cap-binding complex、CBC)相结合,并与其他酶或蛋白一起调控RNA合成、剪切、翻译等功能,其中也包括miRNA的合成、剪切等功能。随着各种科学研究的深入,发现miRNA在肿瘤的形成、增殖过程中起着及其关键的作用,但仍有新的miRNA被不断地发现,并被证明参与到肿瘤进程中。有临床样本显示,Ars2在AML样本中高表达,并与患者预后情况呈明显相关性,但Ars2在AML中的调节机制尚未阐明。结合miRNA近年来的研究,由Ars2表达异常引起的部分miRNA表达异常很有可能是AML发病的诱因之一。以此为出发点,本课题旨在于发掘Ars2在AML形成以及增殖过程中调节的miRNA,以及阐明Ars2通过miRNA调节AML增殖的作用机制,为临床靶向治疗提供基础依据。研究目的:发现Ars2与AML的相关性,探索Ars2在AML中的功能,在体内与体外水平验证Ars2对AML发生增殖所起的作用,研究Ars2通过调控miRNA表达从而影响AML增殖的作用机制,探讨Ars2在AML临床治疗中的应用价值。研究方法:通过查阅多个癌症基因数据库,探寻Ars2在AML患者骨髓中的表达量与AML患者预后的相关关系,使用qRT-PCR检测临床样本中Ars2表达量是否异常。对U937细胞株使用慢病毒载体感染,构建Ars2高表达、Ars2干扰(shArs2)与Ars2阴性对照(Control)细胞株在细胞生殖上的差异,流式细胞技术确定Ars2对AML细胞系的细胞周期有调控作用,再通过Western Blot实验检测细胞周期相关蛋白,筛选出U937在高表达和敲降Ars2之后发生变化的蛋白。构建THP-1、HL-60、K562细胞相应的高表达和敲降细胞株,以相同的技术手段对Ars2在AML中所起作用进行验证。使用慢病毒感染系统构建shArs2-U937细胞株,对CBP80进行免疫共沉淀实验,比较Ars2敲降前后,与CBP80相结合的Ars2蛋白的变化情况。再将shArs2-U937中Ars2进行免疫共沉淀实验,Western Blot检测与Ars2结合的CBP80蛋白变化情况。从而反应Ars2与CBP80是否直接结合。根据miR-6734-3p在染色体上的定位,设计miR-6734-3p前体pri-miR-6734-3p引物,qRT-PCR检测pri-miR-6734-3p表达量,通过观察pri-miR-6734-3p的变化,判断pri-miR-6734-3p在剪切过程中是否被Ars2调节。免疫共沉淀实验检测在Ars2上结合的RNA剪切酶Drosha/Pasha和Dicer1变化情况,判断Ars2调控pri-miR-6734-3p剪切的具体节点。将Control-U937与shArs2-U937细胞株送至广州锐博生物技术有限公司生物公司(Ribobio,Guangzhou,China)进行高通量miRNA芯片检测,并筛选出Ars2正向调节的miRNA集群。通过多个miRNA数据库进行碱基拟合运算,进行靶点预测,找出能与p27/Kip1 3`端序列结合的miRNA集群。再经由qRT-PCR验证,筛选出受Ars2调控且可与p27/Kip1 3`端序列结合的miRNA。使用miRNA mimic将U937中特定miRNA高表达,Western Blot和qRT-PCR实验验证该miRNA是否抑制p27/kip1在蛋白和mRNA水平的表达。于RNA22数据库(cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)中计算出miRNA与p27/Kip1 3`端序列具体的结合位点,再构建相应序列的双荧光素酶报告基因,使用双荧光素酶实验验证靶点序列的有效性。构建miR-6734-3p高表达与低表达U937细胞株,流式细胞实验验证miR-6734-3p对AML细胞周期G1期的影响。qRT-PCR检测病人样本中miR-6734-3p mRNA表达量与正常人样本中表达量的差异。通过尾静脉注射构建小鼠AML模型,分为生理盐水组,U937组,shArs2-U937组。记录各组生存时间与小鼠体重变化;40天取各组小鼠肝肾切片,免疫组化检验病变情况;取小鼠股骨中骨髓,流式细胞检测小鼠骨髓中AML浸润情况。研究结果:1.公共数据库显示Ars2表达量与病人预后相关,Ars2表达量越高预后越差。公共数据库统计结果与临床样本PCR检测结果显示Ars2在AML病人样本中高表达。2.Ars2调控AML细胞增殖与克隆形成能力,Ars2表达量越高AML增殖速率与克隆形成能力越快,Ars2表达缺失AML增殖速率变慢,克隆成球能力变弱。而Ars2是通过调控细胞周期进程来影响AML细胞增殖速度的。3.在AML中Ars2与CBC结合,募集miRNA剪切酶Drosha对pri-miRNA行使剪切功能,从而维持miR-6734-3p的正常合成。miR-6734-3p正常表达时抑制p27表达,当Ars2缺失时会引起miR-6734-3p表达量降低,p27表达量增高,最终导致AML细胞周期G1期阻滞。经实验检测,miR-6734-3p在AML病人样本中高表达。4.小鼠白血病模型中Ars2表达量与AML增殖速度呈现正相关,Ars2缺失可减缓AML浸润速度,推迟小鼠病变时机,延长AML小鼠存活时间。研究结论:1.Ars2高表达会引起AML患者预后情况变差,相较于正常样本,在AML中Ars2呈现高表达趋势。2.Ars2可以调节AML细胞周期从而对AML细胞系生殖速率起正向调控作用。3.在AML中Ars2与CBC结合,募集RNA酶DROSHA维持miRNA剪切,Ars2表达缺失时miR-6734-3p表达量降低,其抑制p27的作用减弱,从而引起AML细胞周期G1期阻滞。miR-6734-3p在AML患者样本中高表达。4.在AML小鼠模型中Ars2调控AML增殖等过程,并呈现量效趋势。5.Ars2与miR-6734-3p在临床治疗上具有成为治疗癌症靶点的潜力与价值。