第一部分WAS蛋白缺陷对记忆T细胞受体多样性的影响背景:T细胞受体(TCR)多样性是T细胞发挥有效免疫功能的重要保障之一。在免疫系统中,TCR组库由所有T细胞克隆组成,每个T细胞克隆通过其TCR特异性识别相应抗原,使免疫系统具备可识别周围环境中几乎所有抗原的潜能。Wiskott-Aldrich综合征(WAS,OMIM#301000)又称湿疹、血小板减少伴免疫缺陷综合征,由WAS蛋白(WASp)缺陷导致,临床主要表现为湿疹、血小板减少、免疫缺陷及易患自身免疫性疾病和淋巴系统肿瘤。WASp主要调节非红系造血系统细胞的肌动蛋白聚合,其缺陷可影响免疫细胞的多种功能。我们课题组与国外研究团队相继发现WAS病人的TCR多样性严重受限。在这些研究结果中,WASp缺陷对T细胞各亚群TCR多样性的影响程度稍有差异,其中记忆T细胞TCR多样性受限最为肯定。众所周知,TCR克隆数易受感染、免疫接种、自身免疫等各种外源性因素的影响。尽管我们在年幼的WAS患儿中也证实了TCR多样性受限,但仍无法完全排除环境因素对TCR多样性的影响。目的:利用WASKO小鼠、骨髓嵌合小鼠模型和高通量测序技术(HST),研究WASp对T细胞各亚群TCRVβ多样性的影响,以探索WASp缺陷是否为导致记忆T细胞TCRVβ多样性受限的固有因素,而非感染或其他外源性因素。方法:我们采用磁珠分选和流式细胞分选技术,分选出WASKO/WT小鼠模型、WASKO/WT小鼠(CD45.2+)与野生型小鼠(CD45.1+)骨髓嵌合模型的T细胞亚群,利用多重PCR的HST和新型UMI定量5’RACE的HST免疫组库测序方法进行检测,通过生物信息学方法全面分析TCRVβ链的互补决定区3(CDR3)的序列,以验证WASp缺陷引起的记忆T细胞TCR多样性受限是否为固有存在。结果:1.运用多重PCR的HST测序方法检测未嵌合WASKO/WT小鼠中CD4+TEM、CD4+TCM、CD4+T Na?ve、CD4+Tscm、CD8+TCM、CD8+T Na?ve和CD8+Tscm 7个T细胞亚群的TCRVβ多样性。经生物学分析发现:与WT组相比,WASKO组中CD8+T Na?ve和CD8+Tscm的香农指数和辛普森指数倒数降低(P<0.05),克隆性指数升高(P<0.05),Chao1指数和Ace指数无统计学差异;其余T细胞亚群的5种多样性指数值在两组间均无统计学差异。整体上,WT和WASKO两组7个T细胞亚群的V、D、J基因的亚家族的取用和TCRVβ的CDR3序列长度无明显差异。2.运用UMI定量5’RACE的HST免疫组库测序技术检测WT小鼠(WASp+,CD45.2+)和WASKO小鼠(WASp-,CD45.2+)骨髓嵌合模型中CD4+TEM和CD8+TCM两组记忆T细胞亚群的TCRVβ多样性,共获得32个样本平均551万个测序读数(305~900万个)。运用生物学分析发现:(1)与WT相比,KO-CD4+TEM的辛普森指数升高、D50降低(P<0.05),而香农指数和Chao 1指数无统计学差异;KO-CD8+TCM与WT相比,4个多样性指数均无统计学差异。与WT相比,KO-CD4+TEM或KO-CD8+TCM的TOP100均无统计学差异。(2)与WT相比,KO-CD4+TEM的丰度比曲线陡而短、Dq与q值的曲线偏下,而KO-CD8+TCM两种曲线位置变化均不明显。(3)用组成份分析(PCA)综合考量TCRVβ多样性发现,KO-CD4+TEM和WT-CD4+TEM两组可以明显区分,而KO-CD8+TCM与WT-CD8+TCM两组基本一致。(4)KO-CD4+TEM与WT-CD4+TEM在V/D/J基因的亚家族的取用上相比发现,TRBV12.2、TRBV30、TRBV31、TRBV4、TRBD1、TRBD2、TRBJ1.1和TRBJ1.4的取用上存在显著差异(P<0.05)。KO-CD8+TCM与WT-CD8+TCM相比,在TRBV12.2、TRBV15、TRBV20的取用上存在显著差异(P<0.05)。(5)运用PCA方法,对V基因、V-J基因组合、V-D-J基因组合情况相比较发现,KO-CD4+TEM和WT-CD4+TEM在V基因上可明显分为两群,但随着组合基因的增多差异变小;KO-CD8+TCM和WT-CD8+TCM两组间的差异较小。(6)与WT相比,KO组中CD4+TEM样本的重叠指数降低(P<0.001)、CD8+TEM样本的重叠指数升高(P<0.001)、CD4+TEM比CD8+TEM的重叠指数升高(P<0.001)。(7)利用VDJTOOLS软件,从“F2”、“R”和“D”三个度量对TCRVβ序列相似性比较发现,KO与WT的CD4+TEM在D度量中最为分散。KO-CD8+TCM与WT相比三个度量都较为集中。(8)KO-CD4+TEM与WT-CD4+TEM相比,酪氨酸下调,而苯丙胺酸、天冬酰胺、结氨酸上调(P<0.05)。KOCD8+TCM与WT-CD8+TCM相比天冬氨酸下调,色氨酸上调(P<0.05)。(9)在CD4+TEM与CD8+TCM两个细胞群中,WT和KO的第6、7位置上的氨基酸疏水性无明显差异。疏水指数和半胱氨酸指数,在WT和KO组中均无统计学差异。(10)TCRVβ序列长度在KO组和WT组的CD4+TEM或CD8+TCM中均无统计学差异。结论:WASp缺陷导致CD4+TEM的TCRVβ多样性受限是内源性的,而对CD8+TCM的TCRVβ多样性影响较小。WASp缺陷可导致CD4+TEM和CD8+TCM在TRB的V、D、J亚基因取用、V-J及V-D-J基因组合、TCRVβ序列相似性和氨基酸组成上的差别,但未对TCRVβ疏水性和序列的长度造成显著影响。第二部分WAS蛋白缺陷对T细胞胸腺输出的影响及机制研究背景:T细胞起源于骨髓,发育成熟在胸腺,其中TRB的V/D/J重排也在胸腺中完成。TCR重组切除环(TRECs)稳定存在于胸腺输出细胞中,可作为胸腺输出的分子标记。Wiskott-Aldrich综合征(WAS)又称湿疹、血小板减少伴免疫缺陷综合征,可按临床表现分为典型WAS、间歇性X连锁血小板减少症(IXLT)、X连锁血小板减少症(XLT)和X连锁粒细胞减少症(XLN)。WASp是肌动蛋白骨架重构的重要调节因子。T细胞功能缺陷是导致Wiskott-Aldrich综合征(WAS)患者免疫缺陷的最重要原因之一。有研究结果证实,WAS患儿有随年龄增长出现逐渐加重的T细胞减少症,多项研究提示其原因可能为T细胞早期发育轻微受损、T细胞活化、增殖能力下降,以及T细胞凋亡增多等。Jilkina等人,检测了两名WAS患儿的TRECs拷贝数,并发现患者的TRECs与健康供者相比正常,提示WASp缺陷并未影响胸腺输出功能。但由于纳入的病人数量受限,WASp缺陷是否导致胸腺输出功能减低,从而影响初始T细胞的数量,还需进一步明确,胸腺输出缺陷与肌动蛋白之间的关系仍需深入研究。目的:本研究以年幼的WAS患儿、XLT患儿及WASKO小鼠为模型,以明确WASp缺陷对T细胞胸腺输出的影响,并探索胸腺输出与肌动蛋白之间的关系。方法:利用一代基因测序方法检测WAS基因,明确致病基因的突变位点。纳入4名典型WAS患儿、4名XLT患儿及年龄相匹配的健康体检儿童。采用流式细胞分析技术(FCM)测定患者或健康供者WASp蛋白在单个核细胞(PBMCs)中的表达情况。通过FCM检测WAS患儿或健康供者外周血中的T细胞亚群占比情况,包括CD4+T细胞、CD8+T细胞及初始T细胞等。采用定量RT-PCR方法检测患者或健康体检及WASKO/WT小鼠外周血TRECs拷贝数。利用磁珠分选患者或健康体检儿童外周血T细胞,进而采用共聚焦显微成像技术,检测T细胞在PMA和离子霉素刺激0 min、5min和30min时F-actin的MFI、TFI和亚细胞定位情况。FCM也用于同时检测T细胞在PMA和离子霉素刺激0 min、5min和30min时F-actin的MFI水平。结果:典型WAS患儿组CD4+T细胞和初始CD8+T细胞数量明显减少(P<0.05)。与健康体检儿童相比,典型WAS患儿和XLT患儿的PBMC中WASp表达降低(分别为P<0.01和P<0.05)。典型WAS患儿和XLT患儿的WASp表达水平无统计学差异。典型WAS患儿与同龄健康体检儿童(HC1)相比,外周血的TRECs拷贝数降低(P<0.05)。XLT患儿与同龄健康体检儿童(HC2)相比,外周血的TRECs拷贝数降低(P<0.05)。典型WAS患儿与XLT患儿相比,外周血的TRECs拷贝数无统计学差异。WASKO小鼠与WT小鼠相比外周血的TRECs拷贝数降低(P<0.01)。用NIS-Elements AR3.2软件分析发现,无论刺激或无刺激状态下WAS患儿的T细胞膜上和细胞质中F-actin的MFI和TFI均较对照组显著减少(P<0.01),且典型WAS比XLT患儿降低的更为明显(P<0.01)。从3D图像的侧面和底部观察分析发现,健康儿童的T细胞F-catin的TFI显著高于XLT患儿(P<0.001),XLT患儿也高于典型WAS患儿(P<0.01)。用FCM检测发现,在刺激或无刺激状态下XLT患儿和典型WAS患儿T细胞F-actin的MFI水平均下降,且与XLT患儿相比典型WAS患儿下降得更为明显(P<0.01)。结论:本研究结果提示WASp缺陷影响T细胞的胸腺输出功能。基于现阶段从患者外周血T细胞获得的结果,提示在T细胞活化过程中F-actin的变化与WASp表达水平相关。我们推测微丝骨架的分布异常是胸腺输出功能受损的一个影响因素。但尚不清楚其主要影响了T细胞在胸腺发育中的哪一阶段。