论文部分内容阅读
太平洋牡蛎隶属于无脊椎软体动物，缺乏适应性免疫系统，主要依靠先天免疫系统抵抗外界病原的侵染。其中血淋巴的吞噬作用和血浆蛋白的调理作用在清除病原过程中发挥着核心作用，本研究通过蛋白质组学等手段，系统的对牡蛎吞噬/调理的分子机制进行了展开研究，同时对两类关键的免疫信号IRF和TRAF6进行结构和功能分析，探讨它们在太平洋牡蛎免疫防御过程中的作用。 1.血浆蛋白CgC1q在调理过程中的作用 本研究通过Bacteria pull-down assay结合质谱测序，从血浆中分离并鉴定了与病原性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）结合的蛋白，暗示了血浆介导的调理过程是一个多分子互作的复杂过程。其中，丰度最高的的是补体样分子C1q，包含一个典型的C1q结构域，对其功能分析发现:1）CgC1q可以和多种革兰氏阴性菌结合，识别细菌表面分子LPS:2）CgC1q分子定位于牡蛎血淋巴细胞的表面，可以和细胞表面受体Cgintegrin相互作用，其中“RGE”motif是integrin识别的关键位点;3）CgC1q可以加强牡蛎血淋巴细胞对细菌的吞噬作用，促进细胞对细菌的清除能力，证明C1q是介导牡蛎病原吞噬作用的主要调理因子。 2.血淋巴吞噬过程的分子基础 为解析牡蛎吞噬作用的分子机制，通过密度梯度离心的方式分离了不同阶段的吞噬体，运用蛋白质组学鉴定了400多个吞噬体相关的蛋白，构建了一个吞噬体形成和成熟的分子作用模型:1）牡蛎血淋巴细胞吞噬体的成熟过程是一个内腔酸化的过程，V-ATPase在内腔酸化过程中起到了重要作用;2）内质网参与了吞噬体的成熟过程，吞噬体成熟后会与溶酶体融合，而线粒体与吞噬体的成熟关系不大;3)RhoGDI通过调节肌动蛋白网络参与牡蛎吞噬体的形成过程，而ROCK在吞噬体的成熟和杀菌过程中发挥功能。 在吞噬体中存在多种半胱氨酸蛋白酶cathepsin（组织蛋白酶），它们属于溶酶体中的关键水解酶，cystatin为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，参与调节半胱氨酸蛋白酶的活性。利用RACE扩增技术，从太平洋牡蛎中克隆了cystatin基因的全长cDNA序列，该基因转录水平在病原刺激明显上升，蛋白酶活性实验显示cystatin基因对半胱氨酸蛋白酶具有极强的体外抑制活性;RNAi cystatin一方面诱导牡蛎体内血淋巴的凋亡，另外一方面血淋巴清除细菌的能力也有所增强，显示cystatin在牡蛎免疫反应中中具有双重功能。 3.免疫信号通路IRF和TRAF6在免疫反应中的功能 IRF是参与调节干扰素响应病原体感染的转录因子家族，通过基因组比对分析获得了IRF家族的三个基因(IRF1a、IRF1b和IRF8)，其中IRF1a和IRF1b位于同一染色体的相邻基因座位，可能起源于一次基因复制现象。三个IRF基因均具有一个N端的DNA结合结构域，亚细胞定位分析显示IRF1a和IRF1b主要分布于HEK293细胞的细胞核中，而IRF8位于细胞质中。进一步实验发现，IRF1a可以高效激活ISRE报告基因的表达活性，而IRF1b对IRF1a的活性具有负调节作用，揭示了无脊椎动物中一种新型的干扰素调节方式。另一个信号通路关键分子TRAF6基因在病原刺激后其转录水平显著增加，双荧光素酶报告基因实验显示，CgTRAF6能有效激活NF-κB报告基因，并且存在剂量依赖性。干扰TRAF6在牡蛎体内的表达后，免疫信号分子IRF的表达量会下调，同时免疫效应分子viperin的表达量也会下调。 综上所述，本研究首次通过蛋白质组学的手段，系统解析了血浆蛋白介导的调理过程和牡蛎血淋巴细胞吞噬体形成和成熟的分子机制。同时对免疫信号中间分子的研究，提出一种新型干扰素表达调控模式，这为阐明牡蛎先天免疫防御机制提供了新的理解和证据。