铁元素的获取对于霍乱弧菌的生存和繁殖起着至关重要的作用。虽然自然界铁元素的含量丰富，但是由于铁的不稳定性，在富含水和氧气的外界环境中容易发生氧化还原反应，其产物难以被微生物利用；在人体中，大量的铁以结合铁蛋白的形式存在，游离的二价铁离子含量极少，难以满足霍乱弧菌的生存要求，因此霍乱弧菌必须夺取血红素中的铁元素来满足自身生存和繁殖的需要。目前，人们已经对霍乱弧菌获取和转运血红素的机制十分了解。大量研究发现霍乱弧菌自身可以释放具有高亲和力的小分子蛋白——载铁素，载铁素能够高效的结合宿主体内的血红素，并通过TonB系统带回到细胞周质，再由PBP将铁元素转给ABC转运系统，ABC系统转运进入胞体。然而，由于血红素不能直接被霍乱弧菌利用，且大量聚集的血红素对细胞膜有破坏作用，所以进入细胞的血红素仍需要经过复杂的生化反应降解血红素并获取其中的铁元素。但是对于血红素进入胞体之后的命运研究者却知之甚少。有研究认为霍乱弧菌的HutZ蛋白可能参与了血红素的胞内降解反应，具有降解酶或者暂时储存血红素的作用。因此我们猜测与HutZ蛋白共用一个启动子，同时表达的HutX蛋白也可能参与了这一反应过程。HutX蛋白属于HutX-ChuX超蛋白家族，具有保守结构域DUF1008，该家族的其他蛋白均被证明具有血红素结合能力，如HemS蛋白具有血红素降解酶的功能，与HutX蛋白同源性最高的ChuX蛋白近期也被证明可以与血红素结合。先前研究认为ChuX在大肠杆菌的铁元素利用过程中起到短时间储存血红素的作用，以防止潜在可能的血红素毒性促进非氧化还原反应破坏细胞膜。因此，我们认为HutX具有潜在的血红素结合能力，并参与了血红素胞内利用的反应过程。目的：验证霍乱弧菌HutX蛋白是否具有血红素结合能力，并分析与血红素结合能力相关的蛋白结构，以此推测HutX蛋白在霍乱弧菌铁元素摄取及利用过程中的作用。方法：为了证实我们的推测，我们采用霍乱弧菌O1biovar EI Tor str. N16961的基因组为模板翻译表达出HutX蛋白，通过镍柱亲和层析、SourceQ阴离子交换柱层析和Superdex200分子筛柱层析等纯化所得蛋白，利用蛋白质印迹法进行验证,获取纯化的HutX蛋白与血红素按照一定的比例充分混合后，进行分光光度测量，并对光谱进行分析；在验证HutX蛋白具有血红素结合能力后，为了进一步分析HutX蛋白与血红素结合的氨基酸残基以及结合方式，我们通过对已知同源蛋白的结构进行分析，推测HutX蛋白与血红素的结合位点，在验证过程中，我们对潜在结合位点突变后纯化获取突变的HutX蛋白，与血红素按相同比例结合后进行分光光度测量，并与野生型HutX-血红素复合物的光谱进行对照。结果：通过验证试验证实我们获取的蛋白为纯化的HutX蛋白，野生型HutX蛋白-血红素复合物所得光谱证明HutX蛋白与血红素形成的复合物所得光谱中存在一大一小两个波峰，对比已知物质的光谱结果以及同源类似物的光谱结果，可以得知HutX蛋白与血红素以六配位键的形式结合，该结构较为稳定，不易于其他物质发生变化，但是HutX蛋白-血红素复合物的小波峰较典型的六配位键物质光谱结果中的小波峰小，而趋向于五配位键的结合形式，所以我们认为HutX蛋白与血红素应该以五配位键、六配位键混合的方式与血红素结合，在溶液中两种结合方式达到平衡，与ChuX蛋白的结合方式相似。我们进一步通过对HutX蛋白的同源蛋白进行结构分析，发现在HutX蛋白的同源类似物中均存在一个保守的结构域，先前对HemS和ChuX蛋白的结构和功能研究已经证明该结构中存在血红素结合位点，且该位点为保守的氨基酸序列，通过氨基酸序列比对，我们推测得到两个潜在的HutX蛋白与血红素的结合位点，H103和F119，紫外-可见光谱结果显示对两个位点分别进行突变后大小两个波峰均消失，仅在波长值约为200nm处获得一个单一的波峰，有可能为HutX二聚体蛋白波峰。因此可以认为突变的HutX蛋白失去血红素结合能力，说明H103和F119均是HutX蛋白结合血红素的关键位点。结论：该实验证明了HutX蛋白具有血红素结合能力，但是HutX-血红素复合物不稳定，与其结合的铁元素处于活跃状态，容易与其他化合物发生反应。因此我们认为HutX蛋白可能具有短暂储存血红素以减少细胞内血红素水平。在霍乱弧菌获取到大量血红素的时候，HutX蛋白结合血红素，以保证积累的血红素毒性不会破坏霍乱弧菌的细胞膜而导致细胞死亡；同时，由于HutX蛋白与血红素结合不紧密，所以其他蛋白可以很容易的从HutX蛋白和血红素的复合物中获取血红素，提取其中二价铁离子加以利用。因此，HutX蛋白以五配位键、六配位键方式与血红素的结合即有利于对细胞膜的保护，也有利于对血红素及二价铁离子的利用。先前对ChuX蛋白的研究发现大肠杆菌的ChuX蛋白具有与HutX蛋白类似的功能，考虑到来两个蛋白在氨基酸序列以及结构上的高度相似性，该研究支持了我们的结论。我们的研究证明HutX蛋白的血红素结合能力和结合位点，并依据此对HutX蛋白的功能进行了推测和讨论，为进一步研究该蛋白的功能以及揭示霍乱弧菌胞体内利用血红素的过程和机制提供了可靠的先前知识准备。