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一、研究背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,是导致人类死亡的主要原因之一。尽管目前已有多种HCC治疗方式应用于临床,但由于存在的副作用,远达不到人们的预期效果。中药(traditional chinese medicine,TCM)在中国传统治疗中发挥了巨大作用,由于其存在治疗HCC的潜力,因而吸引了研究者们的注意。众多研究证实,TCM可以通过多种作用方式延缓肿瘤过程,改善HCC患者的生存质量。东亚钳蝎镇痛抗肿瘤多肽(Buthus martensii Karsch Analgesic-antitumoral peptide,Bm K AGAP)是从蝎毒多肽中分离出来的一种毒素。Bmk AGAP不仅具有镇痛作用,还可以抑制多种恶性肿瘤的增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。因此重组镇痛抗肿瘤多肽(recombinant analgesic-antitumoral peptide,r AGAP)可能成为一种新型的抗肿瘤药物,应用于临床治疗。我们在建立r AGAP高效原核表达系统的基础上,通过蛋白质变复性和超滤截留技术,获得高效的r AGAP蛋白,并通过体内、体外实验,研究其对HCC生长的抑制作用及具体机制。二、研究方法1、通过构建r AGAP基因工程载体,建立r AGAP高效原核表达系统,诱导表达获得包涵体。利用蛋白质变复性技术,对获得的包涵体洗涤、变性、复性,获得高纯度可溶性r AGAP蛋白。并利用超滤截留技术,对复性后蛋白进行浓缩、透析,制备得到高浓度、高活性的r AGAP蛋白。2、在体外通过MTT观察r AGAP对人肝癌细胞株的生长抑制作用。通过流式细胞仪、Western-blot、q RT-PCR实验方法,检测r AGAP对人肝癌细胞周期的阻滞效应。通过流式细胞仪、Hoechst 33258染色、Western-blot、q RT-PCR实验方法,检测药物对人肝癌细胞凋亡的诱导作用。3、在体内观察r AGAP对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的抑制作用,并通过Western-blot、免疫组化、TUNEL检测r AGAP对肝癌组织细胞周期、细胞凋亡的影响。三、研究结果1、为了有效纯化具有功能的r AGAP,我们设计了两种His6标记r AGAP(N-氨基末端His6标记和C-羧基末端His6标记)的重折叠方法。能量优化和分子动力学模拟结果证实,N-氨基末端直接参与了r AGAP核心区域的构成。此外,His6标记的N-氨基末端能够影响r AGAP整个蛋白的结构,甚至能够与r AGAP疏水核心产生相互影响,这一结果被证实与r AGAP活性具有密切关系。此外,使用碱性His6标记N-氨基末端能够使其漂浮于蛋白质表面,从而影响蛋白质表面的电荷分布;而His6标记的C-羧基末端,与蛋白质融合的同时对蛋白质分布没有影响。本研究制备方法得到的r AGAP产量为其他方法的4倍,反相高效液相色谱法分析,制备的r AGAP纯度为95%。根据r AGAP同源模型分析发现,其可能属于长链毒素,主要通过干预Na+通道而发挥其生物学活性。电生理结果证实r AGAP能够显著抑制70%的TTX-R钠离子电流,而TTX-R钠离子电流与痛觉信号、肿瘤转导具有密切关系。2、体外实验(1)MTT结果显示r AGAP对多种人肝癌细胞株的增殖均具有显著抑制作用,并呈浓度依赖性。并且r AGAP对人肝癌Hep G2细胞24h、48h、72h不同时间点的增殖也具有抑制作用,并具有时间依赖性。(2)流式细胞仪、Western-blot、q RT-PCR等检测结果显示,r AGAP可以将人肝癌Hep G2细胞周期阻滞在G1期,能够上调p21、下调CDK2的蛋白表达水平,上调p53、下调CDK2、Cyclin D1的m RNA表达水平。我们推测r AGAP可能是通过调控p21、p53、CDK2、Cyclin D1等细胞周期相关基因发挥其阻滞细胞周期的作用。(3)流式细胞仪、Hoechst 33258染色、Western-blot、q RT-PCR等检测结果显示,r AGAP可以诱导细胞发生早期凋亡,并能够上调Bax、PARP,下调Bcl-2、survivin等凋亡基因的蛋白表达;上调FADD、CRADD基因的m RNA表达。研究还发现,r AGAP可以下调磷酸化ERK1/2和STAT3的蛋白水平,下调STAT3的m RNA水平,而他们是许多凋亡基因的上游基因,因此我们猜测,r AGAP可能通过调节Bax、Bcl-2、survivin、PARP、FADD、CRADD、ERK1/2和STAT3等基因发挥其诱导肝癌细胞凋亡的作用。3、体内实验(1)通过对裸鼠肝癌皮下移植瘤的肿瘤体积及裸鼠体重分析显示,r AGAP能够显著的抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的增殖,并较5-FU组具有用药剂量小的优势。(2)Western-blot结果显示,r AGAP高剂量组(2mg/kg)可以上调p53,下调Cyclin D1的蛋白表达,且对p53的结果优于5-Fu组,因此我们推测,r AGAP在肝癌组织中可能通过调节p53及Cyclin D1发挥阻滞细胞周期的作用。(3)TUNEL结果显示,r AGAP组中凋亡细胞的数目明显增加,r AGAP可以诱导肝癌组织发生凋亡。Western-blot结果证实,r AGAP低、高剂量组(1、2mg/kg)与模型组比较可以显著上调Bax、下调Bcl-2基因的蛋白表达水平,且药物高剂量组对Bax调节的趋势优于5-Fu组。免疫组化结果显示,r AGAP低、高剂量组(1、2mg/kg)与模型组比较,剪切的caspase3阳性表达明显增多。因此,我们推测,r AGAP可以诱导肝癌组织发生凋亡,并可能通过调节Bax、Bcl-2、caspase3等凋亡基因发挥诱导凋亡的作用。四、结论通过改进原核表达系统和变复性技术制备的r AGAP蛋白具有高纯度、高产量、高活性的特点。在对人肝癌细胞以及裸鼠肝癌皮下移植瘤的研究中均发现,制备的r AGAP蛋白不仅可以抑制人肝癌细胞株和裸鼠肝癌皮下移植瘤瘤体的增殖,还可以通过阻滞细胞周期在G1期、诱导细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。