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棉花黄萎病是土传真菌维管束病害，严重降低了棉花纤维的品质与产量。由于黄萎病菌种类复杂、变异性强，因此田间管理以及化学防治效果有限。培育具有棉花黄萎病抗性的新品种是防治黄萎病危害最有效的措施。然而，由于抗黄萎病种质资源匮乏，导致传统抗病育种进展缓慢。随着基因工程和分子生物学的发展，利用分子手段分离和鉴定新的棉花抗病相关基因，为培育具有黄萎病抗性的棉花新品种提供候选基因成为当前的一个研究热点。microRNAs(miRNAs)是一类小的的非编码RNA，通过转录后调控靶基因的表达，参与调控植物生长发育及生物/非生物胁迫响应等过程。剖析miRNA和其靶基因在植物抗病方面的作用机制与功能，对棉花的分子抗病育种具有重要指导意义。
本研究以研究组前期陆地棉接菌诱导响应的sRNA组和降解组数据为基础，筛选出2个表达差异较大的miRNA及其靶基因，分别命名为GhmiR7814和GhmiR8687，相应的靶基因为GhNBS-LRR和GhWATs。以陆地棉BD18为实验材料，对这两个miRNA以及相应的靶基因抗病功能进行分析鉴定。主要研究结果如下：
1.通过对miR7814和GhNBS-LRR组织表达模式，发现miR7814在根、茎、叶、和子叶各组织中均有表达，其中根中表达量最低；而GhNBS-LRR在根中优势表达。miR7814和GhNBS-LRR的黄萎病菌诱导表达模式分析结果显示，它们均受黄萎病菌诱导表达，其中miR7814受黄萎病菌下调表达，而GhNBS-LRR受黄萎病菌显著上调表达。这些结果显示miR7814和GhNBS-LRR表达趋势相反，暗示着GhNBS-LRR受到miR7814调控。
2.利用烟草叶片瞬时表达系统，分别在烟草叶片中共表达GhNBS-LRRWT-GUS和Pre-miR7814，GhNBS-LRRm-GUS和Pre-miR7814。通过GUS染色证明miR7814可以抑制GhNBS-LRR的表达。随后特异引物的qPCR发现miR7814是通过切割靶基因mRNA的方式，降低GhNBS-LRR表达水平。
3.利用VIGS技术获得GhNBS-LRR沉默棉株TRV:GhNBS-LRR，并对其进行黄萎病菌抗性鉴定，发现TRV:GhNBS-LRR棉株的对黄萎病菌的抗性降低；对利用VbMS技术获得miR7814干涉棉株STTM7814进行黄萎病菌抗性鉴定，发现STTM7814棉株对黄萎病菌的抗性增强；利用VbMO技术获得miR7814超表达棉株OE-miR7814，对其进行黄萎病菌抗性分析，发现OE-miR7814棉株对黄萎病菌的抗性降低。这些抗性鉴定结果表明，GhNBS-LRR正调控棉花对黄萎病菌的抗性，而miR7814负调控棉花对黄萎病菌的抗性。
4.在降解组数据中获得一个受黄萎病菌诱导差异表达显著的小RNA，经序列比对将其命名为miR8687。随后对其靶基因GhWAT在棉花中进行同源比对，发现它有3个同源基因，在此将它们分别命名为GhWAT1，GhWAT2和GhWAT3。组织表达模式分析发现GhWAT1，GhWAT2和GhWAT3在各组织中表达趋势相似，均优势表达于根、茎和下胚轴等高度木质化组织。黄萎病菌诱导表达模式显示GhWAT1和GhWAT3受菌诱导上调表达，而GhWAT2表达下调。IAA和SA诱导表达模式显示出相反的表达趋势，即GhWAT1、GhWAT2和GhWAT3受IAA诱导上调，而受SA诱导下调。
5.利用VIGS技术在棉花幼苗中分别和同时沉默3个GhWATs基因，获得棉株TRV:GhWAT1、TRV:GhWAT2、TRV:GhWAT3和TRV:TRV:GhWAT123。发现TRV:GhWAT1、TRV:GhWAT2和TRV:GhWAT3没有明显的表型变化，而同时沉默GhWATs的植株表现出矮化，木质部发育受阻，木质素局部沉积，qPCR结果显示TRV:GhWAT123中木质素合成的相关基因均上调表达。
6.亚细胞定位结果显示，GhWAT1、GhWAT2和GhWAT3均定位于液泡膜上，参与生长素极性运输，且在三个基因共沉默植株中，生长素的极性转运可能发生紊乱，从而造成了SA水平的积累，及SA信号响应相关基因的激活。
7.通过接菌诱导发现，单独沉默GhWATs的植株与对照植株抗性一致，而三个基因共沉默植株明显增强了植株对黄萎病菌的抗性。进一步分析表明GhWATs的抗性与SA的积累和木质素的沉积有关。同时也说明GhWAT1、GhWAT2和GhWAT3存在着功能冗余。
综上所述，miRNA可以通过转录后调控靶基因的表达，参与植株的抗性响应。且不同的miRNA可以作用不同的抗病基因，参与棉花抗黄萎病过程。
本研究以研究组前期陆地棉接菌诱导响应的sRNA组和降解组数据为基础，筛选出2个表达差异较大的miRNA及其靶基因，分别命名为GhmiR7814和GhmiR8687，相应的靶基因为GhNBS-LRR和GhWATs。以陆地棉BD18为实验材料，对这两个miRNA以及相应的靶基因抗病功能进行分析鉴定。主要研究结果如下：
1.通过对miR7814和GhNBS-LRR组织表达模式，发现miR7814在根、茎、叶、和子叶各组织中均有表达，其中根中表达量最低；而GhNBS-LRR在根中优势表达。miR7814和GhNBS-LRR的黄萎病菌诱导表达模式分析结果显示，它们均受黄萎病菌诱导表达，其中miR7814受黄萎病菌下调表达，而GhNBS-LRR受黄萎病菌显著上调表达。这些结果显示miR7814和GhNBS-LRR表达趋势相反，暗示着GhNBS-LRR受到miR7814调控。
2.利用烟草叶片瞬时表达系统，分别在烟草叶片中共表达GhNBS-LRRWT-GUS和Pre-miR7814，GhNBS-LRRm-GUS和Pre-miR7814。通过GUS染色证明miR7814可以抑制GhNBS-LRR的表达。随后特异引物的qPCR发现miR7814是通过切割靶基因mRNA的方式，降低GhNBS-LRR表达水平。
3.利用VIGS技术获得GhNBS-LRR沉默棉株TRV:GhNBS-LRR，并对其进行黄萎病菌抗性鉴定，发现TRV:GhNBS-LRR棉株的对黄萎病菌的抗性降低；对利用VbMS技术获得miR7814干涉棉株STTM7814进行黄萎病菌抗性鉴定，发现STTM7814棉株对黄萎病菌的抗性增强；利用VbMO技术获得miR7814超表达棉株OE-miR7814，对其进行黄萎病菌抗性分析，发现OE-miR7814棉株对黄萎病菌的抗性降低。这些抗性鉴定结果表明，GhNBS-LRR正调控棉花对黄萎病菌的抗性，而miR7814负调控棉花对黄萎病菌的抗性。
4.在降解组数据中获得一个受黄萎病菌诱导差异表达显著的小RNA，经序列比对将其命名为miR8687。随后对其靶基因GhWAT在棉花中进行同源比对，发现它有3个同源基因，在此将它们分别命名为GhWAT1，GhWAT2和GhWAT3。组织表达模式分析发现GhWAT1，GhWAT2和GhWAT3在各组织中表达趋势相似，均优势表达于根、茎和下胚轴等高度木质化组织。黄萎病菌诱导表达模式显示GhWAT1和GhWAT3受菌诱导上调表达，而GhWAT2表达下调。IAA和SA诱导表达模式显示出相反的表达趋势，即GhWAT1、GhWAT2和GhWAT3受IAA诱导上调，而受SA诱导下调。
5.利用VIGS技术在棉花幼苗中分别和同时沉默3个GhWATs基因，获得棉株TRV:GhWAT1、TRV:GhWAT2、TRV:GhWAT3和TRV:TRV:GhWAT123。发现TRV:GhWAT1、TRV:GhWAT2和TRV:GhWAT3没有明显的表型变化，而同时沉默GhWATs的植株表现出矮化，木质部发育受阻，木质素局部沉积，qPCR结果显示TRV:GhWAT123中木质素合成的相关基因均上调表达。
6.亚细胞定位结果显示，GhWAT1、GhWAT2和GhWAT3均定位于液泡膜上，参与生长素极性运输，且在三个基因共沉默植株中，生长素的极性转运可能发生紊乱，从而造成了SA水平的积累，及SA信号响应相关基因的激活。
7.通过接菌诱导发现，单独沉默GhWATs的植株与对照植株抗性一致，而三个基因共沉默植株明显增强了植株对黄萎病菌的抗性。进一步分析表明GhWATs的抗性与SA的积累和木质素的沉积有关。同时也说明GhWAT1、GhWAT2和GhWAT3存在着功能冗余。
综上所述，miRNA可以通过转录后调控靶基因的表达，参与植株的抗性响应。且不同的miRNA可以作用不同的抗病基因，参与棉花抗黄萎病过程。