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低聚半乳糖（GOS）是一类益生效果良好的低聚糖,被广泛应用于食品和保健品行业。工业上一般采用β-半乳糖苷酶催化乳糖获得。目前,日本拥有比较成熟的工业生产技术,年产量也居于世界首位,而国内由于欠缺性能较好的β-半乳糖苷酶、生产技术落后等原因,目前对GOS的生产还处于落后水平。本研究将米曲霉（Aspergillus oryzae RIB40）来源的β-半乳糖苷酶连接到表达载体pPIC9K上,并将重组质粒转入毕赤酵母（Pichia pastoris KM71）,获得了能够表达β-半乳糖苷酶的重组菌。通过定点突变的方法获得了三株转苷能力提升的突变体,并对突变体及野生型酶生产GOS的反应条件进行了优化,对转苷能力最高的双突变体N140C/W806进行了3 L罐发酵,最后分析了突变体产生效果的原因,并对原因进行了验证。主要研究结果如下:（1）将米曲霉来源的β-半乳糖苷酶基因连接表达载体,转入Pichia pastoris KM71,获得能够高效表达β-半乳糖苷酶的重组菌,摇瓶酶活达到198.7 U·mL-1,对野生型基因进行定点突变,获得了多株转苷能力提升的突变株。对突变体动力学参数进行分析,其中,N140C及N140C/W806F突变体对乳糖的Km值比野生型酶有所提高,说明两个突变体对乳糖亲和力下降,水解活性降低,符合实验预期。（2）对突变体及野生型酶生产GOS的条件进行了优化。两个单突变体生产GOS的能力均比野生型有所提高,其中W806F突变体在最优条件下生产GOS的产率达到49.3%,N140C单突变体最优条件下生产GOS的产率达到50.7%,比野生型酶分别提高了35.2%及31.5%。双突变体N140C/W806F的最佳反应条件:乳糖浓度600 g·L-1、加酶量2.5U·mL-1、反应温度为40℃,反应pH 4.5,反应时间7 h。其最终产率为59.8%,比野生型提高了59.2%。对双突变体N140C/W806F进行了3 L罐发酵优化,确定最佳诱导温度为28℃,此时双突变体酶活达到65.3 U·mL-1,比摇瓶提高4.44倍。（3）对突变体产生效果的原因进行了分析,认为N140C突变点氨基酸残基的改变导致半乳糖基氢键的破坏,从而影响水解反应和转苷反应,使得转苷反应相对占据优势,进而最终提高产率。W806F突变产生的效果与此位置疏水性增加有关,疏水性增强降低了水作为受体参与反应的机会,相应的糖基作为受体的反应得到增强,从而提高转苷能力。设计正向突变N140A以及反向突变W806H,其中N140A突变后,生产GOS的产率达到44.9%,比野生型高19.7%,W806H生产GOS产率为22.7%,比野生型降低,成功验证了我们对突变产生效果原因的推测。