马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起的鸡群常见的具有高度传染性的淋巴细胞增生性疾病。该病以胸腺法氏囊萎缩,外周神经、各个脏器、肌肉、皮肤中单核细胞浸润以及由于外周神经肿瘤细胞的集聚而导致的半瘫痪或完全瘫痪为典型特征。MDV在淋巴细胞中复制,并潜伏感染CD4+T淋巴细胞。潜伏性感染的CD4+T淋巴细胞将病毒粒子携带到内脏器官、外周神经及羽毛囊上皮中。感染MDV的鸡羽毛囊上皮中有囊膜的病毒粒子可脱离细胞而存在,带病毒的皮屑的脱落可对鸡群和环境造成污染。根据鸡群对MD致瘤的遗传抗性,美国农业部禽病与肿瘤学研究所已将白来航鸡分为抗MD品系鸡(63)和易感MD品系鸡(72和15I5×71)。免疫同一MD疫苗后,MD遗传抗性品系鸡对MD超强毒力株有更强的抗性,表现为低死亡率。本研究成功建立了63和72品系鸡动物模型,用于比较两种品系鸡对MDV感染产生的不同免疫反应。并进一步建立了15I5×71品系鸡动物模型,探究皮肤对MDV感染产生的免疫反应及其机理。1 63和72品系鸡对MDV免疫反应的比较1日龄63和72品系鸡,分别随机分为两组(实验组和对照组),每组25只。12日龄时,腹腔注射r Md5-BAC(vv MDV),剂量为2000PFU/只,对照组不攻毒。攻毒后第21天,鸡群出现明显的免疫抑制症状,采集鸡冠和脾脏组织,进行免疫组织化学分析、组织病理学分析、革兰氏染色、反转录PCR以及荧光定量PCR方法,来探究63和72品系鸡对MDV感染产生的不同免疫反应。63和72品系鸡有相同的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)单倍型(B2/B2),其中,63品系鸡为MD抗性品系鸡,在感染MDV后,除表现典型的MD相关症状外,还出现了严重的鸡冠和鸡爪的坏疽现象。72品系鸡为MD易感品系鸡,虽未出现坏疽现象,但表现出鸡冠苍白、眼睑扩张,且因暂时麻痹及其他并发症而出现高死亡率。免疫组化结果表明,两种品系鸡鸡冠组织中均有大量的巨噬细胞和淋巴细胞浸润,63品系鸡坏疽鸡冠组织中有大量CD8+T淋巴细胞,而72品系鸡实验组鸡冠中却未检测到;组织病理学结果表明,63品系鸡坏疽鸡冠表皮侵蚀变薄,结缔组织出现淋巴浆细胞浸润,并伴随异嗜性和组织性蜂窝织炎,72品系鸡实验组鸡冠组织表皮轻度侵蚀,且出现严重的淋巴浆细胞性血管炎;革兰氏染色结果表明,63品系鸡鸡冠坏疽组织中存在革兰氏阳性菌,而72品系鸡鸡冠中未检测到;荧光定量PCR结果表明,63品系鸡坏疽鸡冠中,除了IL-8和i NOS,其他基因几乎不表达,而72品系鸡鸡冠中,IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、i NOS和IFN-γ的表达量均上调;反转录PCR结果表明,两种品系鸡的脾组织中,均有meq基因的转录,而鸡冠组织中,只有72品系鸡有meq基因的转录。MD抗性品系鸡63和易感品系鸡72,在感染MDV后表现出不同的免疫抑制症状。其中,63品系鸡虽然为MD抗性品系鸡,但自然状态下,出现了坏疽现象,且感染MDV后,坏疽加重。研究结果提示我们,人为筛选鸡群某种特性(例如MD抗性)的同时,会对鸡群的免疫力产生不利影响,使其对一些病原微生物或环境的抵抗力减弱。2 15I5×71品系鸡皮肤组织对MDV的免疫反应及其机理15I5×71品系鸡对MD的易感性与72品系鸡相似,1日龄15I5×71品系鸡随机分为两组(实验组和对照组),每组15只。12日龄时,腹腔注射r Md5-BAC(vv MDV),剂量为2000PFU/只,对照组不攻毒。攻毒后第26天,鸡群出现明显的免疫抑制症状。通过采集皮肤组织,进行免疫组织化学分析、及荧光定量PCR分析,探究MDV感染导致15I5×71品系鸡羽毛囊上皮的免疫反应、免疫抑制机理及免疫逃避机制。免疫组化结果表明,实验组鸡只羽毛囊上皮细胞中,病毒大量复制,辅助T细胞和巨噬细胞的数量增加,而细胞毒性T淋巴细胞大量缺失。荧光定量PCR结果表明,实验组皮肤组织中大部分基因的表达量均上调,然而,几个重要的免疫相关基因(如:CD107a、ITGA6、TGF-β、IFN-β)的转录活性却降低。尽管整体的基因表达水平表明,机体产生了有效的Th1型免疫反应,但在羽毛囊上皮细胞中,游离于细胞外的病毒粒子的复制不受拘束。由此推测,MDV对15I5×71品系鸡产生免疫抑制的机制,是通过下调CD8的表达量,来抑制细胞毒T细胞的功能,并通过降低细胞粘附分子的表达,来阻止细胞毒性T细胞的迁移。MDV的感染导致细胞毒性T细胞的缺失或者其生物功能的缺乏,使机体缺少一个有效的细胞免疫反应。同时,病毒大量繁殖,对实验组鸡只产生了免疫抑制。