背景和目的在临床盆腹腔肿瘤治疗中,放射治疗是一个重要手段,但其副反应如放射性肠炎等明显影响患者生存质量,限制了放射有效剂量的使用,且尚无有效的治疗手段[1,2]。核恐怖袭击、突发核电站泄漏等均可造成急性放射病,包括肠型和骨髓型。短时间内大量的急性放射病患者给临床救治和护理工作带来极大的挑战。目前放射性肠损伤的体外模型多依赖于2D培养的永生化前体细胞系和肿瘤细胞系,这些细胞系不能较好地模拟在体小肠干细胞的生理功能和特性,并且多存在一些基因突变,对射线的敏感性弱。小肠干细胞(Intestinal stem cells)位于隐窝基底部,目前认为包括穿插于潘氏细胞之间的基底柱状细胞(Lgr5干细胞)和位于Paneth细胞位置以上的表达较低Lgr5水平的相对静止的干细胞。干细胞增殖分裂后的子代细胞沿隐窝-绒毛轴迁移、分化和衰老,到达绒毛顶部后自动脱落于肠腔。电离辐射可诱导隐窝细胞发生一系列快速变化:对放射敏感的Lgr5干细胞快速死亡,存活的干细胞和一些重新获得干性的细胞在周期阻滞后重新进入细胞周期完成隐窝-绒毛的结构重建。这些在体的隐窝细胞的损伤和修复动力过程是2D培养模型不能模拟的,然而体外培养难题阻碍了对干细胞的研究和临床应用。2009年,Hans Clevers实验室成功实现了肠干细胞的体外3D培养,通过基质胶Matrigel提供细胞的基质支持;添加调控关键信号通路的关键因子模拟在体的重要信号通路;模拟体内细胞生长环境,实现了隐窝干细胞在体外长期培养,并形成类器官样结构,为小肠干细胞的研究提供了全新的平台。为了解决辐照损伤修复所面临的小肠干细胞数量、干细胞增殖能力等问题,研究者们将目光投向了各种细胞因子、小分子化合物等领域。但是部分细胞因子和小分子化合物在体实验需要量大、成本高,体外筛选平台的建立提供了研究此类小分子化合物的便利。本实验先后建立体外肠干细胞放射性损伤模型,建立筛选平台,在此基础上对一些针对干细胞本身和可能针对微环境的一些细胞因子和小分子化合物进行初步的筛选,结合体内实验对抗放靶点进行初步筛选和区分,为研究临床治疗和护理工作中减轻肿瘤放疗肠道损伤的副作用的新措施提供新的平台和线索。方法1.放射性肠损伤体外模型的建立分别分离C57BL/6(野生型)、P53-/-小鼠小肠隐窝,于基质胶内接种24h、48h、72h后分别给予X射线4?10 Gy照射。显微镜下观察隐窝的形态学改变,比较两组隐窝克隆出芽过程;MTT染色后计数相同基因型小鼠隐窝在接受不同辐照剂量,照后不同时间点克隆存活率。对接种24h给予6Gy辐照后的野生型小鼠隐窝,通过RT-PCR检测照后24h内不同时间点不同靶基因的表达。检测基因包括Bax、Bbc3、Mdm2、P21、Bcl2l1等P53靶基因以及Lgr5、Olfm4、Ascl2等小肠干细胞特征性基因的表达。2.利用细胞分子IL22、小分子化合物Dmog、FingolimodHCl(盐酸芬戈莫得)对体外放射性肠损伤模型筛选的细胞因子和小分子化合物的作用靶点进行初步筛选野生型小鼠隐窝于接种48h给予6Gy辐照,建立体外放射性肠损伤模型。分别于辐照后6h给予不同浓度的Dmog,辐照前3h给予不同浓度的IL22或者盐酸芬戈莫得。显微镜下观察隐窝的形态学改变,并于辐照后5d计算各组隐窝存活率。另外,在IL22用药后不同时间点提取隐窝总RNA,通过RT-PCR检测照后24h内不同时间点小肠干细胞特征性基因Lgr5及P53靶基因的相对表达量变化。建立全身辐照的放射性肠损伤小鼠模型,于辐照后24h腹腔注射8mg/kg/d的Dmog、辐照前1h腹腔注射不同浓度的盐酸芬戈莫得。辐照后每天观察小鼠体重,精神状态;10Gy辐照的小鼠于辐照后84h取材,12Gy辐照的小鼠于辐照后96h取材;采集大体观察图片,肉眼观察小肠肠管的充盈程度,肠内容物和肠壁厚薄以判断肠损伤程度;HE病理染色小肠组织,观察小肠隐窝的缺失和绒毛的完整性;Brdu染色增殖隐窝,判断小肠隐窝的增殖情况。通过体内实验对体外实验的结果进行进一步验证,初步区分细胞因子及小分子化合物的作用靶点。结果1.正常培养的隐窝能较好模拟在体情况;接种24h隐窝呈圆球形,48?72h隐窝出芽,形成“囊腔”,表现出体内隐窝-绒毛结构。C57BL/6小鼠隐窝在接种24h接受6Gy辐照,照后24h隐窝内出现大量细胞死亡,出芽完全被抑制;P53-/-小鼠隐窝仍继续出芽,存活率显著高于野生型小鼠隐窝(P<0.01)。C57BL/6小鼠隐窝提取RNA,RT-PCR结果显示:P53通路下游基因在辐射后迅速激活,表达量增高;而干细胞的标记基因在辐照后迅速下降,24h达到最低水平。提示此模型能较好地模拟在体P53依赖的肠干细胞辐射损伤修复过程。2.C57BL/6小鼠隐窝接种48h,6Gy辐照后6h给予不同浓度的Dmog,对照组隐窝存活率为(49±4)%;200μM组隐窝存活率为(57±5)%;500μM组隐窝存活率为(56±5)%;1000μM组隐窝存活率为(60±7)%。1000μM组存活率高于对照组,P<0.05,差异有统计学意义。IL22于辐照前3h给药,1ng/ml组隐窝存活率为(69±7)%;3ng/ml组隐窝存活率为(82±9)%;5ng/ml组隐窝存活率为(85±7)%;10ng/ml组隐窝存活率为(60±5)%。不同浓度IL22处理组与对照组比,P值均<0.05,差异有统计学意义。盐酸芬戈莫得于辐照前3h给药,0.5μM组隐窝存活率为(52±10)%;1μM组隐窝存活率为(71±5)%;2μM组隐窝存活率为(20±6)%;4μM组隐窝存活率为(11±2)%。1μM组隐窝存活率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.C57BL/6小鼠在接受10Gy或者12Gy辐照前后,给予不同药物处理后取材(10Gy辐照后84h、12Gy辐照后96h):Dmog用药组:小肠肠腔充盈,内含大量黄色粘液,肉眼观肠壁变薄,与对照组差异不明显。5mg/kg/d的盐酸芬戈莫得用药组与对照组相比较能明显减轻肠腔肿胀,减少小肠内黄色粘液,肉眼观肠壁较对照组厚;HE染色显示(用药组相较于对照组):小肠上皮绒毛结构完整,隐窝结构较完整且数量多,隐窝内细胞多;Brdu染色结果:用药组阳性染色细胞较对照组多,增殖隐窝数明显多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.建立基于3D小鼠小肠隐窝培养的体外放射性肠干细胞损伤模型,证实3D培养小肠干细胞对P53依赖的细胞死亡和周期阻滞、有丝分裂灾难等行为和体内的一致性。2.IL22可以作为针对肠干细胞的辐射保护剂体外筛选的阳性对照;3D肠干细胞体外辐射模型对一些干细胞靶和非肠干细胞靶的辐射保护小分子能进行有效区分。本体系的建立为研究临床治疗和护理工作中减轻肿瘤放疗肠道损伤的副作用的新措施提供新的平台。