1980年科学家通过动物遗传修饰技术获得了转基因动物——转基因小鼠。到目前为止,科学家通过不同基因修饰方法获得各种转基因动物物种。近几年,我国在转基因动物研究领域也有了突破性进展,这些成果为动物育种和研究奠定了坚实的基础。本实验室于2011年后也陆续获得了一批卵泡抑制素FST基因转基因克隆羊。我们对得到的部分FST转基因蒙古羊(NO.14,NO.17,NO.18)和转基因山羊(NO.21)通过PCR、southern blot、western blot、实时定量荧光PCR技术、肌肉组织切片和血液生化分析等技术进行检测分析。研究FST基因的转入对相关基因的表达、个体肌肉发育及动物健康的影响。1)外源基因整合情况的检测本实验采用Southern blot和PCR技术分别对转基因羊外源基因整合情况进行鉴定。结果表明：被检测的四只羊基因组中均有外源基因整合,并且外源质粒的多个位点(SP启动子、α-actin启动子、FST.CMV启动子、DsRed和新霉素抗性基因)均已整合到了转基因羊的基因组中。2)外源基因拷贝数检测本实验以glucagon作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测外源基因的拷贝数。绝对定量PCR的标准曲线为：log5N=-0.415△Ct+0.0194(R2= 0.9911)(△Ct为外源基因Ct与内参基因Ct的差,N代表拷贝数),计算得到NO.14、NO.17、NO.18和NO.21转基因羊中外源基因的拷贝数分别为4、10、3和1。3)FST基因的表达分析利用实时定量荧光PCR技术检测FST基因mRNA的相对表达量。结果表明：与普通蒙古羊,山羊相比,在NO.14、NO.17、NO.18和NO.21转基因羊的肌肉组织中FST的相对表达量分别为1.125、1.021、1.959和1.157倍,MSTN的相对表达量分别是1.804、2.235、1.495和1.102倍,BMP4的相对表达量分别为0.504、0.135、0.165和0.265倍；与对照相比,转基因羊NO.14、NO.17、NO.18和NO.21的皮肤组织中FST的相对表达量分别为1.101、1.089、1.156和0.868倍,MSTN的相对表达量分别是1.172、1.134、1.203和1.230倍,BMP4的相对表达量分别为0.978、1.021、1.142和0.451倍。选取GAPDH作为内参,利用western blot技术检测FST和MSTN蛋白的相对表达量。western blot结果显示：与普通绵羊相比,转基因绵羊NO.14、NO.17、 NO.18肌肉组织中FST蛋白相对表达量分别为1.05、1.13和1.05倍,转基因绵羊NO.14、NO.17、NO.18肌肉组织中MSTN蛋白相对表达量分别为0.81、0.70和0.76倍。与普通山羊相比,转基因山羊NO.21肌肉组织中FST蛋白相对表达量为1.72倍,转基因山羊NO.21肌肉组织中MSTN蛋白相对表达量为0.69倍。4)FST转基因羊个体水平检测分析对三只转基因蒙古羊(NO.14, NO.17, NO.18)和一只转基因山羊(NO.21)肌肉做石蜡切片,并进行HE染色,分析其肌纤维密度和肌纤维直径。结果发现,转基因蒙古羊NO.14、NO.17、NO.18的肌纤维密度分别为246根/毫米2、235根/毫米2、233根/毫米2,普通蒙古羊的肌纤维密度为213根/毫米2,转基因蒙古羊的肌纤维密度大于普通蒙古羊对照；转基因山羊NO.21的肌纤维密度为271根/毫米2,也大于普通山羊的肌纤维密度(224根/毫米2)。转基因蒙古羊NO.14、NO.17、N0.18肌纤维直径分别为55.38微米、64.32微米、58.93微米,普通蒙古羊的肌纤维直径为49.06微米,转基因山羊肌纤维直径大于普通山羊对照；转基因山羊NO.21肌纤维直径为62.58微米,大于普通山羊的肌纤维直径(50.69微米)。另外,对转基因羊进行血液生化分析,包括肝功、肾功、血糖和血脂分析。结果表明,转基因蒙古羊和转基因山羊的各项指标均与普通蒙古羊和普通山羊无明显差异。以上结果显示,目的基因FST的高表达可抑制MSTN和BMP4的表达,进而促进肌肉的生长和发育。本实验初步建立了对转基因动物各个水平检测的体系,为今后对转基因动物进行更深层次的研究打下了基础。