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目的:粉防己碱(Tetrandrine,简称Tet,分子式: C38H42N2O6)是从中草药粉防己块根中提取的双苄基异喹啉生物碱,具有逆转P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)介导的肿瘤多药耐药(multidrug resisitance, MDR)作用。本研究通过体外实验探讨粉Tet对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP耐药性的逆转作用,并通过检测耐药相关基因—多药耐药基因(MDR-1)与肺耐药相关基因(LRP),探讨Tet逆转卵巢癌多药耐药的作用机制,为其应用于临床提供理论依据。方法:1选取人卵巢癌细胞株SKOV3及耐药细胞株SKOV3/DDP进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法检测不同浓度的顺铂(DDP)对SKOV3及SKOV3/DDP细胞增殖的抑制效应,并根据耐药指数计算公式计算出SKOV3/DDP细胞的耐药指数(reverse index, RI)。2采用MTT法检测不同浓度Tet对SKOV3/DDP的细胞毒作用,并选取非细胞毒性药物浓度的Tet(细胞增殖抑制率<10%)作为后续实验浓度。3采用MTT法测定非细胞毒性药物浓度的Tet干预48h后,SKOV3/DDP对DDP敏感性的变化,并根据逆转倍数计算公式计算出Tet的耐药逆转倍数(reverse fold, RF)。4采用逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)法检测非细胞毒性药物浓度的Tet干预0h, 24h, 48h, 72h后,SKOV3/DDP细胞中MDR-1、LRP mRNA表达情况。5采用流式细胞术(flowcytometry, FCM)检测非细胞毒性药物浓度的Tet干预0h, 24h, 48h, 72h后,SKOV3/DDP细胞中MDR-1、LRP编码的蛋白P-gp及LRP蛋白的表达情况。6采用FCM法测定非细胞毒性药物浓度的Tet联合DDP作用后,SKOV3/DDP细胞凋亡和周期分布情况。结果:1 SKOV3/DDP细胞株的RI:MTT结果显示,不同浓度的DDP作用48h后,DDP对SKOV3/DDP细胞的IC50为6.24μg/ml,对SKOV3的IC50为2.37μg/ml,RI为2.63。2筛选Tet逆转多药耐药的实验浓度:MTT结果显示,2μmol/L及更低浓度的Tet对SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率小于10%,故选取2μmol/L作为Tet逆转多药耐药的实验浓度。3 Tet对SKOV3/DDP细胞株的耐药逆转倍数:MTT结果显示:2μmol/L Tet联合不同浓度的DDP作用48h后,DDP对SKOV3/DDP细胞的IC50从单用DDP时的6.24μg/mL降为3.89μg/mL,RF为1.60倍。4 Tet对SKOV3/DDP细胞内MDR-1、LRP mRNA表达的影响:RT-PCR检测结果显示,2μmol/L Tet干预24h, 48h, 72h后,SKOV3/DDP细胞内MDR-1 mRNA的相对表达量分别为:0.221±0.018,0.074±0.013 , 0.073±0.011 ;与对照组(Tet干预0h)的相对表达量0.778±0.017比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。72h组与48h组比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。2μmol/L Tet干预24h, 48h, 72h后,SKOV3/DDP细胞内LRP mRNA的相对表达量分别为:0.789±0.012, 0.680±0.014, 0.544±0.025;其中48h组和72h组与对照组(Tet干预0h)的相对表达量0.777±0.016比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05),但24h组与对照组比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。5 Tet对SKOV3/DDP细胞内P-gp、LRP蛋白表达的影响:FCM测定结果显示,2μmol/L Tet干预24h, 48h, 72h,SKOV3/DDP细胞内P-gp蛋白的荧光指数(FI)值分别为:0.843±0.012, 0.811±0.008, 0.806±0.010,48h组、72h组与24h组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),但72h组与48h组比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。2μmol/L Tet干预24h, 48h, 72h,SKOV3/DDP细胞内LRP蛋白的FI值分别为:0.992±0.003, 0.964±0.002, 0.955±0.002,三组间两两比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。6 Tet联合DDP对SKOV3/DDP细胞凋亡的影响:FCM检测SKOV3/DDP细胞凋亡的结果显示,DDP组和Tet+DDP组均测得典型的亚二倍体凋亡峰。在DDP组、Tet组、Tet+DDP组和对照组,凋亡百分率(%)分别为:24.607±1.201、0.963±0.495、32.660±1.247、0.511±0.353。DDP组、Tet+DDP组凋亡百分率显著高于对照组,三组间两两比较差异均具有统计学意义(均P<0.05),Tet组凋亡率与对照组比较,差异不具统计学意义(P>0.05)。6 Tet联合DDP对SKOV3/DDP细胞周期分布的影响:FCM检测SKOV3/DDP细胞周期的变化的结果显示,在对照组、DDP组和Tet+DDP组中,细胞分布于G0/G1期的比例分别为:58.175±0.982, 58.400±0.637, 12.663±0.978;细胞分布于S期的比例分别为:21.088±1.722, 28.950±1.334, 86.426±0.972;细胞分布于G2/M期的比例分别为:20.738±1.380, 12.650±1.097, 0.912±0.082。DDP组与对照组比较,细胞分布于S期的比例增多,分布于G2/M期的比例减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Tet+DDP组与DDP组比较,细胞分布于S期的比例显著增多,分布于G0/G1和G2/M期的比例显著减少,差异均具有统计学意义(P<0.01)。细胞周期的变化在Tet组与对照组间,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1单用Tet在一定范围内能抑制SKOV3/DDP细胞的体外增殖,其增殖抑制率随着Tet活性浓度增加相应上升。2非细胞毒性浓度的Tet能够部分逆转SKOV3/DDP细胞的耐药性,其逆转机制可能与其下调P-gp蛋白和LRP蛋白的表达有关。3非细胞毒性浓度的Tet联合DDP,可发挥协同作用抑制SKOV3/DDP细胞的增殖并诱导其凋亡,并使SKOV3/DDP细胞周期停滞于S期。4 Tet可能作为一种有效的MDR逆转剂应用于耐药卵巢癌的治疗,但仍需后续深入研究进一步阐明其作用机制。