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目的:非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是指除酒精与其他明确的肝损伤因素所致外的以弥漫性肝大泡性脂肪变,伴或不伴炎症为主要特征的临床病理综合征。虎金方在临床上使用二十余年,有扶正祛瘀,利湿解毒之功效,对于病机属痰湿内生,气滞血瘀的脂肪肝、胆囊炎、肝炎均有一定的改善作用。前期研究表明此方能改善NAFLD模型小鼠肝功能和血脂,并改善肝组织病理情况及肝细胞超微结构。本实验拟通过建立NAFLD小鼠模型,以脂肪酸代谢为切入点,探讨其NAFLD小鼠模型中脂肪酸代谢失调的发病机制及虎金方对其的治疗作用及机制,为临床应用中医药治疗NAFLD提供科学依据。方法:实验研究以高脂饲料喂食法建立NAFLD模型,将小鼠随机分为正常组与造模组。造模十周后,将造模组随机分为为模型组、虎金方低、中、高剂量组。正常组和模型组小鼠按1 ml/100 g给予0.9%生理盐水灌胃;虎金方各组分别按高(2.124 8/ml)、中(1.062 g/ml)、低(0.531 g/ml)剂量给与虎金方浓煎药液灌胃,每日一次,共4周。造模及给药期间每周称量小鼠体重,并观察一般状况。末次给药后处死小鼠收集血液用于检测血清AST、ALT、TC、TG。并取整块肝脏,称重并肉眼观察其外观大小、质地、及颜色。一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定,用于后续H&E染色和油红0染色。剩余肝脏组织-80 ℃冰箱保存用于后续的Western blot 法检测 SIRT1、PGC-1 α、PPAR-α、CPT1A、ACOX1 蛋白的表达以及 RT-PCR 法检测CPT1A、ACOX1mRNA 的表达。结果:1.给药后小鼠的一般情况变化:造模前各组小鼠体重基本相同。造模开始后,模型组小鼠体重逐渐增加,从第2周后开始高于正常组(P<0.05),至造模最后一周,已与正常组的差距非常明显(P<0.001)。给药后,与正常组相比,模型组最终体重显著增加(P<0.001),而与模型组比较,高剂量组小鼠最终体重下降明显(P<0.05)。取材后,肉眼观察小鼠肝脏,正常组小鼠肝脏呈暗红色,形态大小正常,边缘锐利;模型组小鼠肝脏呈黄色,体积明显增大,包膜紧张,肝表面可观察到许多脂肪颗粒。称量各组肝湿重后,与正常组小鼠比较,模型组组小鼠肝脏重量增加明显(P<0.001),而与模型组比较,各给药组小鼠肝湿重均有所降低(P<0.001)。2.给药后小鼠肝功能血脂改变:给药后,与正常组比较,模型组小鼠血清AST、ALT上升明显(P<0.001,P<0.001);虎金方各组组小鼠AST、ALT与模型组比较有所下降,其中中高剂量组下降趋势明显(P<0.001,P<0.001),呈现出剂量依赖性的趋势。同时给药后,与正常组相比,模型组小鼠血脂(TC、TG)明显上升,(P<0.05,P<0.001),各给药组小鼠血脂水平均下降,其中TG改变较为明显(均P<0.001)。3.给药后小鼠病理形态的变化:HE染色可见,正常组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞大小正常,结构完整,排列规则,呈放射状排列。模型组小鼠肝小叶结构被破坏,肝细胞肿胀变形,细胞核被挤至一侧,胞内脂质聚集呈气球样变,并伴有轻微炎性细胞浸润。给药后,肝细胞形态相对完整、排列相对整齐,脂质沉积状况改善,气球样变数量减少。油红0染色可见,正常组小鼠肝细胞基本未见脂质沉积,而模型组小鼠肝细胞内可见大量脂滴,给药后肝细胞内脂滴减少,脂质沉积有所减轻。4.小鼠肝脏组织中CPT1A、ACOX1蛋白与基因的表达:模型组CPT1A、ACOX1蛋白表达量较正常组下降明显(均P<0.001)。各给药组中,两个蛋白的表达均有所上升,尤其是中、高剂量组。与模型组相比,中、高剂量组的CPT1A蛋白表达上升(P<0.05;P<0.05);中、高剂量组的 ACOX1 蛋白表达上升(P<0.05;P<0.001)。RT-PCR结果显示,与正常组相比,模型组小鼠肝组织CPT1A、ACOX1mRNA表达量明显下降(P<0.05;P<0.05)。各给药组中,两个基因的表达均有所上升,尤其是高剂量组。与模型组相比,中、高剂量组的CPT1AmRNA表达上升,有显著性差异(P<0.05;P<0.01);高剂量组的ACOX1mRNA表达上升,有显著性差异(P<0.01)。5.肝脏组织中Sirt1、PGC-1 α、PPAR-α蛋白表达含量:与正常组相比,模型组SIRT1、PGC-1 α、PPAR-α 蛋白表达量均明显下降(P<0.05,P<0.001,P<0.05)。给药后,各给药组SIRT1、PGC-1 α、PPAR-α蛋白表达量均有所上升。其中低、中剂量组PGC-1 α、PPAR-α表达量有显著性差异(均P<0.01,P<0.05)。而高剂量组效果最为明显,SIRT1、PGC-1 α、PPAR-α蛋白表达均增加明显(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。高剂量组PPAR α表达量甚至略微超过正常组的表达量。结论:1.给予虎金方后,小鼠的一般情况明显好转,体重肝重降低,肝功能指标(AST、ALT)血脂水平(TC、TG)均降低。说明虎金方能在一定程度上减轻小鼠的肥胖情况,以及改善肝损伤和血脂水平。2.给予虎金方后,小鼠肝脏病理变化减轻,HE及油红0染色显示小鼠肝脏组织中脂肪沉积减少,肝小叶结构及肝细胞形态趋于正常。说明虎金方能够减缓长期喂食HFD对肝脏造成的影响。3.给与虎金方后,小鼠肝脏CPT1A、ACOX1蛋白及基因的表达较模型组上调,呈剂量依赖性表现,说明虎金方能够影响线粒体及过氧化物酶体的脂肪酸氧化过程。4.给与虎金方后,各给药组SIRT1、PGC-1 α、PPAR-α蛋白表达量均有所上升,其中高剂量组表现最为明显。说明虎金方可能通过SIRT1/PGC-1 α/PPAR-α通路激活脂肪酸氧化的限速酶,从而增加脂肪酸氧化的速率,减轻肝脏脂肪的沉积。