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目的:分离鉴定小花清风藤药材中黄酮类成分;运用多指标成分定量分析和指纹图谱定性分析的技术手段，对小花清风藤药材进行质量控制与质量评价方法研究;基于中药谱效关系的研究思路，对小花清风藤不同提取部位的抗氧化和抗炎活性进行探索，筛选其抗氧化和抗炎的物质基础。为小花清风藤药材质量标准及其抗氧化和抗炎作用机制的研究提供科学依据。
方法:1.采用多种分离色谱技术相结合，对小花清风藤的醇提物进行脱色、分离纯化，应用TLC、HPLC跟踪监测，分离得到纯度较高的单体化合物，根据其理化性质，质谱(MS)、1H-NMR和13C-NMR等波谱数据及文献比对，鉴定其结构。2.采用比色法，通过对显色条件的优化、样品提取方法的考察等，以齐墩果酸为对照品，5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，检测波长为541nm，测定药材中以齐墩果酸计总皂苷的含量。3.在单因素试验基础上，通过响应曲面法考察乙醇浓度、乙醇用量和提取时间三个因素对总黄酮提取效率的影响，并对其提取工艺进行优化;采用比色法，以芦丁为对照品，于397nm波长处测定吸光度值，并计算药材中以芦丁计总黄酮的含量。4.采用一测多评法，以多点校正、斜率校正和定量因子校正3种方法分别建立山奈酚-3-O-香糖苷(Ⅴ)与槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(Ⅰ)、Camellianoside(Ⅱ)、Tsubakioside A(Ⅳ)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(Ⅵ)的相对校正因子;并对其耐用性和系统适用性进行考察，采用两点推导校正方程法来定位色谱峰;利用外标一点法和回归方程法，对QAMS法进行验证，以评价该法的科学性与可行性。结合GraphPad Prism7和SimCa14.1软件对小花清风藤药材进行质量分析评价。5.采用HPLC法，建立七种黄酮类成分的多指标同时测定含量方法，结合总黄酮与总皂苷的测定结果，利用GraphPad Prism7和SPSS16.0软件进行分析比较。6.采用HPLC法，通过对供试品溶液的提取条件筛选，色谱条件优化，分别构建小花清风藤药材不同入药部位及其叶不同提取部位的HPLC指纹图谱方法，结合相似度评价(SA)、聚类分析(HCA)以及主成分分析(PCA)进行分析评价。7.通过DPPH、ABTS和FRAP法对小花清风藤药材不同提取部位及8个单一黄酮类成分的抗氧化活性进行研究，应用GraphPad Prism7与SPSS16.0软件对结果进行分析。结合相应的色谱图，采用偏相关分析法及灰色关联度分析法构建小花清风藤抗氧化“谱-效”关系的模型，并对各成分的抗氧化能力进行排序。8.以脂多糖(LPS)刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞为体外炎症模型，采用CCK-8实验对RAW264.7细胞的活性进行检测，在相对安全剂量下，采用硝酸还原酶法测定RAW264.7细胞中一氧化氮(NO)的浓度和采用Elisa法测定炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。
结果:1.从小花清风藤中分离得到8个黄酮类化合物，分别鉴定为:槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(Ⅰ)、Camellianoside(Ⅱ)、芦丁(Ⅲ)、Tsubakioside A(Ⅳ)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(Ⅴ)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(Ⅵ)、山奈酚(Ⅶ)和小花清风藤苷(Ⅷ);其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ为首次从小花清风藤及清风藤属植物中分离得到，化合物Ⅷ为新化合物。2.小花清风藤中总皂苷含量多数呈现叶＞一年生茎＞多年生茎的趋势，其中叶部位的含量在3.205～16.66mg/g，一年生茎部位的含量在0.9734～6.582mg/g，多年生茎部位的含量在1.445～5.173mg/g。3.确定小花清风藤药材中总黄酮的最佳提取工艺:乙醇浓度为80％，乙醇用量为56mL，提取时间为96min;小花清风藤药材中总黄酮含量依次为叶＞一年生茎＞多年生茎，其中叶部位的含量在9.122～34.63mg/g，一年生茎部位的含量在3.000～15.53mg/g，多年生茎部位的含量在1.680～9.834mg/g。4.在规定值的±5％内，以化合物Ⅴ为内参物，计算得化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ与Ⅵ的多点校正相对校正因子规定值分别为1.08、0.868、1.02、1.19;斜率校正相对校正因子规定值分别为1.06、0.852、0.809、1.19;化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ与Ⅵ的定量因子校正的定量因子分别为183.41、147.13、139.70、172.65、205.31。理论保留时间和实测保留时间的RD值均低于2.0％，可见参照各方程式，两点法能较准确的定位各色谱峰;同一仪器、不同色谱柱与不同仪器、同一色谱柱的相对校正因子RSD值均小于5.0％，相对校正因子耐用性考察的RSD值均小于2.0％，说明所建立的一测多评法适用范围广;5种定量方法的t检验结果均为P＞0.05，表明5种定量方法计算得到的结果无显著性差异。通过SimCa14.1软件整体综合分析结果显示X13、X25与X37的评分较高，质量相对较优。5.小花清风藤中总黄酮的含量分布呈现:嫩叶＞老叶＞嫩茎＞根＞老茎，总皂苷的含量分布呈现:老叶＞嫩叶＞根＞嫩茎＞老茎;绘制不同生长期的小花清风藤叶中总黄酮、总皂苷及七种黄酮类成分含量的积累动态图。主成分综合分析结果显示2月份采集的小花清风藤药材质量最优，其次是3～4月。6.小花清风藤叶、一年生茎和多年生茎中依次标定了15、10和9个共有峰，且多数样品的相似度大于0.60。小花清风藤叶部位的聚类分析结果显示，当矢量余弦距离为20时，可分为三大类;当矢量余弦距离为10时，可分为六大类;当矢量余弦距离为5时，可分为十二大类。主成分分析结果显示，共提取4个主成分因子，总体排名在前20的样品贵州省占55％、云南省占50％、广西省占40％;表明以贵州产的小花清风藤药材品质较优;所建立的小花清风藤的对照图谱与同属植物进行比较，相似度为0.005～0.561，说其能有效鉴别小花清风藤与同属其他植物。7.小花清风藤抗氧化能力的强弱呈现水部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位的趋势，并对三种方法的结果分别进行方差分析，结果显示均有P＜0.05，表明所得结果具有统计学意义。偏相关分析及灰色关联度分析的谱效关系结果表明，乙酸乙酯部位提取物中化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅵ及F8对抗氧化能力的贡献率较大;水部位提取物中对抗氧化能力贡献较大的是化合物Ⅱ、Ⅳ和Ⅷ。8.在安全剂量下，小花清风藤药材石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位的抗炎活性与剂量成正相关，且对RAW264.7细胞中的一氧化氮(NO)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度均有降低作用。9.以维生素C为阳性对照，8个黄酮类成分对DPPH与ABTS+自由基的清除能力的强弱依次为化合物Ⅱ＞化合物Ⅵ＞化合物Ⅷ＞化合物Ⅰ＞化合物Ⅳ＞VC＞化合物Ⅲ＞化合物Ⅶ＞化合物Ⅴ。在安全剂量下，6个黄酮类成分对RAW264.7细胞中的NO、IL-6、TNF-α浓度均有降低作用，且存在剂量依耐性。
结论:通过分析评价38批不同产地的小花清风藤样品，所建立的小花清风藤药材多指标成分质量控制方法和指纹图谱定性分析方法的专属性强，具有良好的重现性和稳定性，并能较全面地反映小花清风藤药材的内在质量，本文所建立的小花清风藤多元质控方法为该药材质量标准研究提供了实验依据。研究结果表明，小花清风藤药材有较好的抗氧化及抗炎作用，初步筛选出抗氧化及抗炎的药效物质基础，为该药材的抗氧化及抗炎作用机制深入研究提供了理论依据，同时也为小花清风藤药材的综合利用及相关产品的开发奠定基础。
方法:1.采用多种分离色谱技术相结合，对小花清风藤的醇提物进行脱色、分离纯化，应用TLC、HPLC跟踪监测，分离得到纯度较高的单体化合物，根据其理化性质，质谱(MS)、1H-NMR和13C-NMR等波谱数据及文献比对，鉴定其结构。2.采用比色法，通过对显色条件的优化、样品提取方法的考察等，以齐墩果酸为对照品，5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，检测波长为541nm，测定药材中以齐墩果酸计总皂苷的含量。3.在单因素试验基础上，通过响应曲面法考察乙醇浓度、乙醇用量和提取时间三个因素对总黄酮提取效率的影响，并对其提取工艺进行优化;采用比色法，以芦丁为对照品，于397nm波长处测定吸光度值，并计算药材中以芦丁计总黄酮的含量。4.采用一测多评法，以多点校正、斜率校正和定量因子校正3种方法分别建立山奈酚-3-O-香糖苷(Ⅴ)与槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(Ⅰ)、Camellianoside(Ⅱ)、Tsubakioside A(Ⅳ)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(Ⅵ)的相对校正因子;并对其耐用性和系统适用性进行考察，采用两点推导校正方程法来定位色谱峰;利用外标一点法和回归方程法，对QAMS法进行验证，以评价该法的科学性与可行性。结合GraphPad Prism7和SimCa14.1软件对小花清风藤药材进行质量分析评价。5.采用HPLC法，建立七种黄酮类成分的多指标同时测定含量方法，结合总黄酮与总皂苷的测定结果，利用GraphPad Prism7和SPSS16.0软件进行分析比较。6.采用HPLC法，通过对供试品溶液的提取条件筛选，色谱条件优化，分别构建小花清风藤药材不同入药部位及其叶不同提取部位的HPLC指纹图谱方法，结合相似度评价(SA)、聚类分析(HCA)以及主成分分析(PCA)进行分析评价。7.通过DPPH、ABTS和FRAP法对小花清风藤药材不同提取部位及8个单一黄酮类成分的抗氧化活性进行研究，应用GraphPad Prism7与SPSS16.0软件对结果进行分析。结合相应的色谱图，采用偏相关分析法及灰色关联度分析法构建小花清风藤抗氧化“谱-效”关系的模型，并对各成分的抗氧化能力进行排序。8.以脂多糖(LPS)刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞为体外炎症模型，采用CCK-8实验对RAW264.7细胞的活性进行检测，在相对安全剂量下，采用硝酸还原酶法测定RAW264.7细胞中一氧化氮(NO)的浓度和采用Elisa法测定炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。
结果:1.从小花清风藤中分离得到8个黄酮类化合物，分别鉴定为:槲皮素-3-O-龙胆双糖苷(Ⅰ)、Camellianoside(Ⅱ)、芦丁(Ⅲ)、Tsubakioside A(Ⅳ)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(Ⅴ)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(Ⅵ)、山奈酚(Ⅶ)和小花清风藤苷(Ⅷ);其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ为首次从小花清风藤及清风藤属植物中分离得到，化合物Ⅷ为新化合物。2.小花清风藤中总皂苷含量多数呈现叶＞一年生茎＞多年生茎的趋势，其中叶部位的含量在3.205～16.66mg/g，一年生茎部位的含量在0.9734～6.582mg/g，多年生茎部位的含量在1.445～5.173mg/g。3.确定小花清风藤药材中总黄酮的最佳提取工艺:乙醇浓度为80％，乙醇用量为56mL，提取时间为96min;小花清风藤药材中总黄酮含量依次为叶＞一年生茎＞多年生茎，其中叶部位的含量在9.122～34.63mg/g，一年生茎部位的含量在3.000～15.53mg/g，多年生茎部位的含量在1.680～9.834mg/g。4.在规定值的±5％内，以化合物Ⅴ为内参物，计算得化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ与Ⅵ的多点校正相对校正因子规定值分别为1.08、0.868、1.02、1.19;斜率校正相对校正因子规定值分别为1.06、0.852、0.809、1.19;化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ与Ⅵ的定量因子校正的定量因子分别为183.41、147.13、139.70、172.65、205.31。理论保留时间和实测保留时间的RD值均低于2.0％，可见参照各方程式，两点法能较准确的定位各色谱峰;同一仪器、不同色谱柱与不同仪器、同一色谱柱的相对校正因子RSD值均小于5.0％，相对校正因子耐用性考察的RSD值均小于2.0％，说明所建立的一测多评法适用范围广;5种定量方法的t检验结果均为P＞0.05，表明5种定量方法计算得到的结果无显著性差异。通过SimCa14.1软件整体综合分析结果显示X13、X25与X37的评分较高，质量相对较优。5.小花清风藤中总黄酮的含量分布呈现:嫩叶＞老叶＞嫩茎＞根＞老茎，总皂苷的含量分布呈现:老叶＞嫩叶＞根＞嫩茎＞老茎;绘制不同生长期的小花清风藤叶中总黄酮、总皂苷及七种黄酮类成分含量的积累动态图。主成分综合分析结果显示2月份采集的小花清风藤药材质量最优，其次是3～4月。6.小花清风藤叶、一年生茎和多年生茎中依次标定了15、10和9个共有峰，且多数样品的相似度大于0.60。小花清风藤叶部位的聚类分析结果显示，当矢量余弦距离为20时，可分为三大类;当矢量余弦距离为10时，可分为六大类;当矢量余弦距离为5时，可分为十二大类。主成分分析结果显示，共提取4个主成分因子，总体排名在前20的样品贵州省占55％、云南省占50％、广西省占40％;表明以贵州产的小花清风藤药材品质较优;所建立的小花清风藤的对照图谱与同属植物进行比较，相似度为0.005～0.561，说其能有效鉴别小花清风藤与同属其他植物。7.小花清风藤抗氧化能力的强弱呈现水部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位的趋势，并对三种方法的结果分别进行方差分析，结果显示均有P＜0.05，表明所得结果具有统计学意义。偏相关分析及灰色关联度分析的谱效关系结果表明，乙酸乙酯部位提取物中化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅵ及F8对抗氧化能力的贡献率较大;水部位提取物中对抗氧化能力贡献较大的是化合物Ⅱ、Ⅳ和Ⅷ。8.在安全剂量下，小花清风藤药材石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位的抗炎活性与剂量成正相关，且对RAW264.7细胞中的一氧化氮(NO)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度均有降低作用。9.以维生素C为阳性对照，8个黄酮类成分对DPPH与ABTS+自由基的清除能力的强弱依次为化合物Ⅱ＞化合物Ⅵ＞化合物Ⅷ＞化合物Ⅰ＞化合物Ⅳ＞VC＞化合物Ⅲ＞化合物Ⅶ＞化合物Ⅴ。在安全剂量下，6个黄酮类成分对RAW264.7细胞中的NO、IL-6、TNF-α浓度均有降低作用，且存在剂量依耐性。
结论:通过分析评价38批不同产地的小花清风藤样品，所建立的小花清风藤药材多指标成分质量控制方法和指纹图谱定性分析方法的专属性强，具有良好的重现性和稳定性，并能较全面地反映小花清风藤药材的内在质量，本文所建立的小花清风藤多元质控方法为该药材质量标准研究提供了实验依据。研究结果表明，小花清风藤药材有较好的抗氧化及抗炎作用，初步筛选出抗氧化及抗炎的药效物质基础，为该药材的抗氧化及抗炎作用机制深入研究提供了理论依据，同时也为小花清风藤药材的综合利用及相关产品的开发奠定基础。