超广谱β-内酰胺酶(extended-speetrum β-lactamases，ESBLs)是可水解三代头孢菌素和单环β-内酰胺类抗生素的一大类β-内酰胺酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产生。近年来产ESBLs菌株在临床上的分离率不断增加，已经成为院内感染的主要病原菌之一。有关ESBLs的研究，尤其是基因水平的研究是目前国际上临床微生物学界研究的热点之一。在我国产ESBLs菌株的检出率较高，有关ESBLs基因水平的研究报道较少，因此我们就ESBLs，尤其是ESBLs基因方面作了如下研究：收集浙江省8个地区医院和浙江大学医学院附属第一医院临床分离的362株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，评价ESBLs表型的筛选方法，鉴定产ESBLs菌株中SHV型酶基因型分布情况，并研究一种新SHV型β-内酰胺酶的特性。1．超广谱β-内酰胺酶的检测方法比较及相关基因学研究 目前ESBLs表型检测方法有双纸片法(double disk test，DDT)、E test法、三维试验、Vitek法及1999年全美临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的酶抑制剂增强的纸片扩散法和酶抑制剂增强的肉汤稀释法(inhibitor potentiated broth dilution test,IPBDT)，但由于后两种方法的试剂费用贵、购买及操作不便，而临床微生物学实验室需要一种简便、易行、可靠、经济的ESBLs表型检测方法。我们采用IPBDT、DDT、Etest法、Vitek法检测68株临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌、10株标准产酶大肠埃希菌及1株大肠埃希菌ATCC 25922中产ESBLs的情况。以IPBDT检测结果为标准，评价DDT法、E test法和Vitek 法的ESBLS检测结果。发现DDT、E test法和ViteK法的特异度均较高，而灵 敏度分别为96．4％、70．4％和75．9％，提示与E test法和Vil：eK法相比，DDT是 一种可以替代IPBDT的简便易行的ESBLS表型检测方法。对5株DDT和IPBDT 检测结果不符合的细菌进行p－内酞胺酶基因分型，发现其中2株细菌产生的是 非IEM非SHV型p－内酞胺酶，另3株产生的是不属于ESBLS的TEMl型卜二 内酞胺酶，造成表型与基因型检测不符合的原因可能与细菌IE：M4型酶产量高 有关。 2．浙江省产超广谱卜内棚酶菌株SRV型p－内硼隧因型分布 采用IPBDT检测1998年9月1 年6月浙江省8个地区医院和浙江大学 医学院附属第一医院临床分离的362株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，共筛选出 119株产 ESBLs菌株。用聚合酶链反应中olpoerase chain reaCtion，PCR）和斑 点杂交的方法对其所产ESBLS进行初步分型，其中单独产TEM型和单独产SHV 型p－内酞胺酶的细菌分别占55．5％和 10．9％，同时产IEM、SHV型的占 13．4％， 产非IEM非SHV型的占20二％。浙江省内各地区ESBLS基因型流行情况不同。 将其中29株细菌所产的SHV型p－内酞胺酶基因片段分别克隆入pGEM－Te卿 载体，双脱氧链终止法测定核昔酸序列，序列分析结果在网上查询比对，确定 SHV基因型，发现 SHV－且型 4株，SHV－5型 1株，SHV－11型吕株，SHV．12 型 8株和 SHV毛8型 8株，提示 SHV＊、SHVl 和 SHV－28型是 SHV型p－内 酞胺酶在产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的主要流行基因型。 3．新型卜内硼酶SHV－28的发硼其特性的研究 采用PCR方法获得浙江省宁波和舟山地区临床分离的吕株表型鉴定为产 ESBLS肺炎克雷伯菌所产SHV型p－内酞胺酶的基因，该片段含888个核苦酸， 4 基因克隆、序列分析结果显示核昔酸及相应的氨基酸序列在GenBank查询无相 同序列，为新发现的一种p－内酞胺酶SHV毛8型（GenBank f录号：M99299人 将该型基因片段与pET毛8b表达型载体连接后转入大肠埃希菌中表达，测定重 组细菌所表达的重组蛋白等电点为7．6：重组细菌酶抑制剂增强的纸片扩散法鉴 定为非产ESBLs细菌；脉冲场凝胶电泳研究发现这8株临床分离株相互之间的二 亲缘关系较小，说明产SHV28型酶菌株有可能是独立发生的，不存在耐药菌’株的克隆传播；接合试验的结果提示SHV28型卜呐酞胺酶基因位于质粒上。 以上研究表明： 1．以WBDT检测结果为标准，与E test法和Vil：ej’法相比，DDT是一种简便、 特异、敏感、经济的ESBLs表型检测方法，可在临床实验室中推广使用。 2在浙江省产ESBLS大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，TIM型是其产生的主要卜 内酞胺酶基因型。SHV型p－内酞胺酶有 5种基因型，其中 SHVl、SHV刁 和 SHV上8型是主要流行SHV型卜内酞胺酶基因型，且不同基因型SHV型p－内酞 胺酶在不同地区流行情况不同。 3．浙江省宁波和舟山地区8株临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌中首次发现一 种新型p－内酞胺酶GHV毛8型人