第一部分感染与原发免疫性血小板症患者相关性的回顾性评价背景研究原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种复杂的自身免疫性疾病,表现为血小板计数降低和出血性症状增加。作为临床最常见的出血性疾病,ITP约占成人临床出血性疾病的30%。ITP世界每年发病率为3.2-12.1/10万。最新流行病学数据表明,除育龄期妇女外,男女发病率相当。ITP的临床表现主要为血小板降低导致的皮肤或粘膜局部的出血点或瘀斑,严重者甚至出现颅脑及其他重要脏器出血。糖皮质激素为经典一线治疗策略。最近研究发现,大剂量地塞米松可作为成人ITP一线治疗策略中首选的皮质类固醇激素。一线治疗失败者可采用二线药物治疗(如促血小板生成药物、利妥昔单抗等)或脾切除。目前研究认为,ITP主要以血小板破坏增多和/或血小板生成减少为特点,抗原特异性自身抗体介导的血小板吞噬增加和/或细胞毒T细胞对血小板的直接破坏是血小板消耗增多的重要原因;而自身免疫介导的巨核细胞成熟障碍和凋亡异常则会导致ITP患者血小板生成减少。血小板减少症是病毒性和细菌性感染患者常见症状,而感染是慢性ITP患者临床常见并发症,也可能是ITP的诱发因素,发病率和死亡率均较高,其主要是由于皮质类固醇激素和其他免疫抑制剂等药物所致。最新研究表明,ITP感染不仅与免疫调节治疗有关,还与疾病本身相关,ITP血小板减少可以引起免疫力下降进而导致患者感染风险增加。对于ITP患者感染的相关研究目前较少,感染和ITP的相关性及其相互作用机制尚不清楚,亦缺少详实的临床资料统计分析患者的感染风险。为进一步研究感染和ITP之间的关系,解释临床现象,指导临床工作,我们进行了病例回顾性研究。研究目的1.分析感染是否会加重ITP患者血小板计数的降低。2.评估ITP患者血小板减少和感染的相关性,阐明血小板计数在感染风险中的作用。3.进一步探讨ITP患者感染对血小板计数的影响。研究方法我们选择了 Wei等人的前瞻性多中心随机临床试验中ITP患者队列的数据,回顾性分析了其中158名患者的相关数据。研究分组为感染和非感染的ITP患者1.对两组ITP患者的性别、年龄、自身抗体表达、治疗种类和血细胞计数等数据进行统计学分析。2.对两组ITP患者在不同时间点血小板计数进行统计学分析。3.对两组ITP患者激素治疗反应率及住院时间进行统计学分析。4.对两组ITP患者针对血小板输注的反应性进行分析。5.对感染组ITP患者,利用血小板计数作为感染的风险因子,分析血小板计数和感染的相关性。研究结果1.在分组治疗后的第一个月里,38例患者有细菌或病毒感染,感染率为24%。分析感染和非感染ITP患者的年龄、性别、自身抗体、血常规(t=0)和激素治疗等方面数据,两组比较无显著性差异(P>0.05)。2.当t=0时,比较感染和非感染ITP患者的血小板计数,无显著性统计学差异(11.8±10.4×109/LVS 13.8±12.8×109/L,P>0.05);当 t=7,14,28 天时,感染ITP患者的血小板计数明显低于非感染ITP患者(P<0.01);t=21天时两组患者的血小板计数无显著性差异(P>0.05)。3.感染ITP患者对激素治疗的反应率明显低于非感染ITP患者(P<0.05)。感染ITP患者的住院时间明显多于非感染患者(P<0.01)。4.ITP患者血小板计数与感染显著相关。Spearman相关系数为-0.517(P<0.01);Pearson相关系数为-0.447(P<0.01)。对于感染ITP患者,血小板计数是感染的危险因子,其危险比为0.52(HR 0.52,95%CI 0.35-0.77,P=0.001)。5.91例患者(58%)在治疗的第一个月给予一次或多次血小板输注治疗。非感染ITP患者,血小板输注可轻度提升血小板计数,与未给予血小板输注的ITP患者比较无显著统计学差异(P>0.05);感染ITP患者经血小板输注后,血小板计数无明显变化,与未给予血小板输注的ITP患者比较无显著统计学差异(P>0.05)。结论综上所述,感染是原发免疫性血小板减少症患者常见的临床并发症。可导致原发免疫性血小板减少症患者对激素治疗反应性降低,住院时间延长,而低血小板计数也增加感染的风险。意义感染是原发免疫性血小板减少症常见的临床并发症,可致各种治疗反应不佳和患者住院时间延长。我们通过研究初步探讨低血小板计数和感染的相关性,还需要进一步研究低血小板计数在感染ITP中的相关机制及输注血小板治疗的时机,为解决临床问题提供理论依据。第二部分 感染与ITP相关性研究的小鼠模型建立及机制探讨研究背景感染指细菌、病毒、真菌或寄生虫等病原微生物侵入机体所致的局部或全身性炎症反应。细菌感染是临床常见的感染形式,分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染。大肠杆菌是临床最为常见的革兰氏阴性致病菌。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)又称为细菌内毒素,是革兰氏阴性菌发挥毒性最重要的成分,它与蛋白质、磷脂共同构成革兰氏阴性菌的外膜。长期研究结果证实,革兰氏阴性菌通过脂多糖参与脓毒血症、感染性休克及多器官功能衰竭等病理过程。革兰氏阴性菌感染可以加重血小板的消耗和破坏,使血小板计数明显降低,其感染程度与血小板减少程度相关。Chen等人研究证明细菌内毒素脂多糖是单核巨噬细胞的一种非常有效的激活剂,这种内毒素的释放可能导致自身免疫性疾病患者单核巨噬细胞的吞噬作用增强或进一步放大。近年来对血小板的研究发现,血小板除了在止血方面发挥核心作用外,还通过与白细胞和内皮细胞直接作用,以及通过释放可溶性炎症介质来辅助和调节炎症反应和免疫反应,这些炎症介质可以促进白细胞的募集并触发白细胞的激活。在ITP的研究中也发现血小板具有免疫调节和保护作用,参与病原体与宿主防御系统之间的相互作用。血小板表面具有大量的受体分子,使血小板能够快速感知入侵的病原体及感染引起的炎症,是身体的报警器。最近研究发现血小板可以降低感染所引起的血浆促炎因子浓度的升高,抑制巨噬细胞依赖的炎症反应,从而抑制感染性休克的发生和发展。原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种免疫介导的血小板破坏增多、生成减少的出血性疾病,其主要临床表现为血小板减少。感染是临床治疗ITP患者常见的并发症,前期研究发现ITP患者主要为细菌感染,且血小板计数和感染时间、治疗效果及住院时间呈负相关。但两者之间的关系及作用机制尚不清楚,因此针对细菌感染是否为加重ITP的危险因素,我们进行了脂多糖对ITP小鼠模型影响及相关机制研究。研究目的1.建立稳定的ITP小鼠模型,通过腹腔注射或尾静脉注射细菌内毒素脂多糖(LPS)模拟ITP小鼠细菌感染模型。检测血小板计数,研究LPS感染是否能加重ITP小鼠血小板减少。2.探究细菌内毒素脂多糖(LPS)升高对ITP小鼠模型的影响及机制研究。流式细胞术检测LPS感染小鼠胸腺和脾脏细胞中Treg细胞比例变化,研究Treg细胞在LPS加重ITP小鼠血小板减少中的作用。3.流式细胞术检测LPS感染ITP小鼠脾细胞悬液中单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞M1比例,检测LPS感染的ITP小鼠外周血血小板在单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞M1中的粘附比例,探究LPS加重ITP小鼠血小板减少的相关作用机制。4.探究细菌内毒素脂多糖(LPS)在ITP中的作用,解释临床现象且提供可能的治疗方向。研究方法1.建立ITP小鼠被动模型。小鼠腹腔注射CD41抗体(MWReg30),检测血小板计数。2.建立合并脂多糖(LPS)感染的ITP小鼠模型。ITP小鼠模型腹腔注射或尾静脉注射大肠杆菌内毒素LPS,检测感染ITP小鼠血小板计数。3.LPS感染ITP小鼠留取外周血后处死,解剖取脾脏,称重,进行形态比较。4.制作合并LPS感染的ITP小鼠胸腺和脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测胸腺细胞和脾细胞中Treg细胞比例变化。5.制作合并LPS感染的ITP小鼠脾脏单细胞悬液,流式细胞法检测脾脏单核细胞、中性粒细胞、巨噬M1细胞的比例。6.LPS感染后4小时留取ITP小鼠外周血,流式细胞术检测外周血血小板在单核细胞、中性粒细胞、巨噬M1细胞中的粘附比例。研究结果1.成功建立稳定ITP小鼠模型及LPS感染ITP小鼠模型。2.LPS感染可以显著降低ITP小鼠的血小板计数。比较4组小鼠在Day0、Day1、Day3、Day5的血小板计数差异,结果显示在Day0时4组小鼠血小板计数未见明显统计学差异(P>0.05);Day1、Day3、Day5三个时间点,LPS感染ITP小鼠血小板计数明显低于非感染ITP组、LPS组和对照组(P<0.05)。3.LPS感染能刺激ITP小鼠脾脏增大。LPS感染ITP小鼠脾脏体积和重量明显大于ITP组小鼠和对照组小鼠(P<0.05)。4.LPS感染能影响ITP小鼠胸腺和脾脏CD4+CD25hiFoxp3+Treg细胞的比例。LPS感染的ITP小鼠CD4+CD25hiFoxp3+Treg细胞比例明显低于ITP组、LPS组、对照组小鼠,两组比较有统计学差异(P<0.05)。5.LPS感染ITP小鼠脾脏单核细胞比例与ITP组、LPS组并无显著差异(P>0.05)。LPS感染ITP小鼠外周血血小板在单核细胞中粘附比例明显低于ITP 组(P<0.05)。6.LPS感染ITP小鼠脾脏中性粒细胞比例与ITP组、LPS组并显著差异(P>0.05)。LPS感染ITP小鼠外周血血小板在中性粒细胞中粘附比例明显低于 ITP 组(P<0.05)。7.LPS感染ITP小鼠脾脏M1细胞比例低于ITP组,两组间比较无显著性差异(P=0.2);LPS感染ITP小鼠脾脏M1细胞比例高于LPS组,两组间比较有显著性差异(P=0.02)。LPS感染ITP小鼠外周血血小板在M1细胞中粘附比例高于ITP组,两组间比较无统计学差异(P=0.6);LPS感染ITP小鼠外周血血小板在M1细胞中粘附比例低于LPS组,两组间比较有统计学差异(P=0.002)。结论感染是原发免疫性血小板减少症患者常见的并发症。革兰氏阴性菌感染是细菌感染常见致病菌,LPS是革兰氏阴性菌的主要致病因素。我们的实验结果表明LPS感染可以加重ITP小鼠血小板计数的降低程度,影响ITP小鼠CD4+CD25hiFoxp3+Treg细胞比例的表达,影响单核细胞、中性粒细胞、巨噬M1细胞的比例及血小板在单核细胞、中性粒细胞、巨噬M1细胞中的粘附比例,加重ITP小鼠免疫失衡。综上所述,LPS可能通过多种机制加重ITP患者血小板破坏。意义感染是原发免疫性血小板减少症常见的临床并发症,感染合并ITP的患者常出现血小板计数持续降低,对药物治疗反应差,出血症状重等临床表现。通过对LPS感染合并ITP小鼠模型的研究,探讨LPS加重血小板减少的相关原因,为临床工作提供科学依据,进一步探究治疗方案。