紫外线（Ultraviolet,UV）是一种重要的环境因子,会导致细胞内活性氧和炎症的积累,直接或间接的影响基因组的稳定性,可引起晒伤,甚至会诱发皮肤恶性肿瘤,如黑色素瘤,基底细胞癌等。血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）作为一种重要的多功能蛋白,通过上调表达响应紫外线的照射,并能催化降解血红素来发挥抗炎症、抗氧化和抗凋亡等作用。因此,探究紫外线对皮肤细胞中HO-1的调控作用,将有助于揭示其在光损伤防护中的具体机理。紫外线作为一种具有能量的电磁波,其照射过程伴随着能量的传递并具有热效应。紫外线能够引起皮肤晒伤,晒伤一般为皮肤I-II度烫伤,晒伤与烫伤统称皮肤灼伤。烫伤可诱发典型的皮肤炎症,而烫伤的愈合是一个长期且复杂的程序性的修复过程,常常伴随着细胞增殖,迁移和组织的重构。研究发现HO-1可在损伤组织周围被迅速诱导表达,过表达HO-1可促进细胞增殖和皮肤伤口的愈合,在血管生成和血管化中也发挥着重要作用,对组织修复过程十分重要。乳香酸（AKBA）作为一种五环三萜化合物,可调节细胞炎症反应和降低细胞内的活性氧的累积,同时也是HO-1的诱导剂。鉴于HO-1在损伤修复中的重要作用,因此探究乳香酸在烫伤中的作用,将有助于更好的揭示乳香酸与HO-1的调控关系。此外,在UVA导致HaCaT角质形成细胞的光损伤中,乳香酸对HO-1和HO-2间的关系也仍不清楚。过多的紫外线暴露以及晒伤史导致黑色素细胞的DNA损伤,从而诱发癌变是黑色素瘤发生的主要诱因之一,但对于黑色素瘤的形成的确切病因仍不清楚。恶性黑色素瘤由于具有高转移能力、抗化疗、抗放疗和高死亡率,已成为目前公认的临床肿瘤治疗中最具挑战性的课题。研究发现HO-1作为一种在肿瘤细胞中高表达的蛋白,具有抗凋亡、促细胞增殖和迁移等作用,同时HO-1的高表达可能与肿瘤的抗化疗和抗放疗性质有关。因此,探究并寻找一种有效的治疗黑色素瘤的药物变得十分重要。芹黄素（4’,5,7-三羟基黄酮）作为一种低毒的膳食类黄酮,具有广泛的抗癌作用,能够通过抗增殖和促凋亡来阻止乳腺癌、肝癌、胰腺癌等的发展。芹黄素对紫外线诱发的小鼠皮肤癌变有一定的抑制作用。在黑色素瘤和黑色素细胞中芹黄素对内质网应激通路中HO-1的作用机制仍不清楚。因此,阐明HO-1及其上游信号通路,如内质网应激通路,Nrf2/HO-1在皮肤光损伤、烫伤和黑色素瘤中的潜在作用,将有助于揭示保护性分子HO-1在不同程度的皮肤光化学及热力学损伤中的作用机理,为相关的皮肤疾病的预防和治疗提供相应的研究基础。本文系统的阐述了在UVA引起的HaCaT细胞光损伤中,HO-1与HO-2的潜在作用关系及乳香酸的光防护效用,探究了乳香酸在小鼠烫伤修复中的作用。此外,在黑色素瘤和黑色素细胞中,探讨了 UVA和芹黄素对内质网应激通路及下游HO-1基因的表达影响。基于上述研究目的,本文主要包括以下内容:1血红素氧合酶家族在光损伤中的作用在HaCaT细胞中降低HO-1和HO-2后,UVA会进一步促进细胞的皱缩、体积缩小,使细胞间接触减少,细胞活力显著降低,凋亡数目和ROS积累水平显著增加,同时伴随着LDH渗漏的增强。推测HO的下调表达会增加细胞对UVA的敏感性,并降低HaCaT细胞的光防护作用。此外,UVA和AKBA可分别增强eIF2α的磷酸化水平。高剂量的AKBA能增加HO-1和HO-2的mRNA表达,同时AKBA能降低UVA诱导的ROS积累。推测AKBA介导HO-1和HO-2的表达可能与细胞的光防护作用相关。2乳香酸介导HO-1在急性烫伤中的作用低剂量的AKBA能够改善小鼠急性热损伤并增加JB6细胞中STAT3的表达,高剂量的AKBA降低STAT3和EGFR的mRNA表达。AKBA上调HO-1的表达并降低UVA诱导的ROS积累且对JB6细胞的迁移无明显影响。细胞增殖和迁移相关的基因HO-1、ATF4、STAT3和MMP-13在小鼠烫伤后表达增加。免疫组化显示,HO-1、ATF4和Nrf2在皮肤烫伤早期高表达,随着烫伤愈合而逐渐降低表达。在皮肤组织和细胞中发现STAT3和HO-1存在共定位,推测可能存在相互作用且在组织修复过程中扮演着重要作用。3芹黄素介导HO-1在黑色素瘤中的作用3.1芹黄素改变A375细胞中内质网应激通路及HO-1的表达芹黄素（0-50 μM）处理后,可降低PERK、HO-1和STAT3等基因的mRNA和蛋白质表达,UVA（0-500 KJ/m2）照射后6小时也观察到相似的现象。UVA照射后12小时,ATF4、Nrf2、PERK和HO-1的mRNA上调表达。推测HO-1可能参与并受内质网应激通路调控。3.2芹黄素呈时间性改变A375细胞中内质网应激通路及HO-1的表达芹黄素处理0-24小时后,可影响PERK的下游Nrf2及eIF2a/ATF4通路,从而降低下游基因HO-1的表达,并降低STAT3的表达。推测可能与芹黄素调控HO-1表达,抑制肿瘤细胞的增殖而参与抗肿瘤的机制相关。3.3芹黄素联合UVA介导内质网应激通路改变A375细胞周期和凋亡UVA单独照射A375后6小时可降低HO-1表达,但会上调ATF4和CHOP的mRNA表达。UVA联合芹黄素后,ATF4、CHOP、PERK的表达显著下调,并上调DR5表达。UVA和芹黄素对黑色素瘤细胞HO-1的抑制作用有助于降低其抗氧化保护效应,增加ROS的累积毒性,后期的ROS检测也印证了这一点。而ATF4、CHOP和DR5的上调,可能与细胞凋亡的发生相关,后续的凋亡检测也证实UVA和芹黄素的双重作用增加黑色素瘤细胞的早期凋亡率。CyclinD1在芹黄素或/和UVA照射后3或12小时上调,在芹黄素以及联合UVA照射后6小时,其mRNA显著下调。P21在芹黄素联合UVA照射3小时后,显著下调表达。P21和CyclinD1与细胞周期相关,细胞周期检测也证实UVA和芹黄素的双重作用能增加细胞在S期的阻滞数目。这些结果提示,UVA联合芹黄素在ROS累积、凋亡增加、细胞增殖阻滞方面对黑色素瘤细胞的抑制都有协同增效作用。3.4在A375细胞中ATF4和Nrf2存在相互作用并调控HO-1的表达过表达ATF4能够诱导野生型HO-1和缺失型（Truncated）的HO-1的表达,意味着内质网应激通路可能通过ATF4调控HO-1的表达。缺失型的HO-1可能与基因损伤和肿瘤发生相关。过表达Nrf2会增加HO-1和ATF4的表达。免疫共沉淀（Co-IP）结果显示Nrf2和ATF4以及HO-1与STAT3可能存在相互作用。推测Nrf2和ATF4的相互作用可能与调控HO-1在黑色素瘤中的表达相关。4芹黄素和UVA在黑色素细胞中的作用4.1 UVA诱导黑色素细胞中的HO-1及其调控因子表达呈剂量性UVA照射及联合芹黄素处理黑色素细胞后3、6、12小时,HO-1的mRNA均显著上调。Bach1是HO-1的负调控因子。芹黄素和UVA的联合处理可降低Bach1的表达。UVA单独照射可增加Bach2的mRNA水平,但联合芹黄素后可抑制Bach2表达。STAT3是HO-1的负调控因子。UVA联合芹黄素及UVA照射后3、6小时后,能降低STAT3 mRNA的表达。推测Bach1和STAT3的抑制可能与HO-1的上调表达相关。ATF4和Nrf2是HO-1的调控因子。芹黄素联合UVA以及UVA照射后3小时可上调ATF4表达。联合UVA照射后12小时,ATF4和Nrf2上调表达。推测可能参与HO-1的上调表达。UVA（0-500 KJ/m2）照射6小时后,上调HO-1、ATF4和Nrf2 mRNA表达。在黑色素细胞中STAT3与HO-1存在共定位。推测黑色素和黑色素瘤细胞中HO-1及调控因子对UVA的响应存在表达差异,提示芹黄素和UVA联合作用对黑色素瘤细胞具有选择性,对黑色素细胞可能更具保护性。4.2芹黄素能降低黑色素细胞中的HO-1表达芹黄素可降低STAT3、HO-1、ATF4和Nrf2等基因的表达,说明芹黄素在黑色素细胞中可降低HO-1及相关调控因子的表达。推测在黑色素细胞中,芹黄素可能会影响细胞增殖相关基因。这也有助于进一步阐明在黑色素细胞中芹黄素的潜在功能以及与HO-1间的调控关系。