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一、目的1.应用分子生物学方法研制新型血管生长抑制剂嵌合分子VEGI+。2.制备出理想的人恶性淋巴瘤的动物模型,在体内水平应用各种实验方法探讨嵌合分子VEGI+对人恶性淋巴瘤的抑制作用。二、方法1.设计特异性引物,通过PCR方法获得VEGI与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI+,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a(+)重组,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,His-Ni++金属鏊合柱对表达产物纯化。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot对表达产物进行鉴定。2.应用人恶性淋巴瘤细胞CA-46接种于6-8周龄的BALB/c裸鼠右背部皮下,接种前每只裸鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,1/日,共2次。两周后100%成瘤,成功构建裸鼠移植瘤模型。选用肿瘤大小相近的裸鼠20只,随机分为4组。在4组裸鼠的瘤体内分别多点注射嵌合分子VEGI+、单纯VEGI、单纯寡肽及PBS,1/日,治疗7天。3.抗肿瘤疗效观察:每日观察裸鼠的生活状态,各组裸鼠开始治疗后分别于第0、7、14、21、28天用游标卡尺测量经过中心点的肿瘤的最长径(A)和经过中心点的肿瘤最短径(B),计算肿瘤体积(V)=A×B2/2及计算肿瘤生长抑制率,公式为:抑瘤率=(对照组体积或瘤重-治疗组体积或瘤重)/对照组体积或瘤重×100%。4.通过病理切片HE染色、原位细胞凋亡检测、免疫组化、瘤内微血管密度检测、荧光定量PCR(Real Time PCR)以及半定量RT-PCR(逆转录酶PCR)等主要手段分别来观察肿瘤组织的病理变化,肿瘤新生血管的抑制情况以及VEGF、MMP-2、MMP-9的表达情况。三、结果1.酶切鉴定及测序结果表明,构建的融合基因VEGI+与预期结果相符。构建好的表达质粒pET30a-VEGI+转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳显示其表达形式以包涵体为主。经过复性和纯化,SDS-PAGE电泳及Western-blot结果表明,嵌合蛋白VEGI+的分子量为23KD左右,纯度约90%。2.建立了裸鼠人恶性淋巴瘤动物模型,裸鼠在实验期间生存状态良好,无死亡;四组肿瘤体积随着时间不断增长,但嵌合分子VEGI+组的生长速率明显减慢,自治疗第7天测量,肿瘤体积就明显小于PBS组,组间体积差异非常显著(P<0.01);单纯VEGI组、单纯寡肽组与PBS组相比肿瘤生长也受到抑制,组间体积差异显著(P<0.05)。治疗28天后,以PBS组作为对照组,嵌合分子VEGI+组比单纯VEGI组、单纯寡肽组具有更高的肿瘤生长抑制率;而单纯寡肽组又比单纯VEGI组的效果好。3.常规HE染色结果显示嵌合分子VEGI+组可见瘤组织变性坏死后的大量结缔组织增生,纤维化明显。TUNEL法显示嵌合分子VEGI+组肿瘤细胞大量凋亡。免疫组化VEGF/CD34染色显示嵌合分子VEGI+组只有很少的VEGF的表达,微血管密度值为26.3±4.5,与其它各组差异均显著(P<0.05)。荧光定量RT-PCR显示嵌合分子VEGI+组VEGF mRNA的相对表达量为1.0021±0.023,与其它各组差异均显著(P<0.05)。半定量RT-PCR显示嵌合分子VEGI+组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量分别为0.09±0.003和0.04±0.002,与其它各组差异均显著(P<0.05)。四、结论1.成功的构建了重组表达载体pET30a-VEGI+,并在大肠杆菌中诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的嵌合蛋白VEGI+。2.嵌合分子VEGI+对恶性淋巴瘤具有明显的抑制作用,可以作为一种有效的靶向于恶性淋巴瘤血管的治疗药物,具有良好的发展前景。