论文部分内容阅读
第一部分比较不同局麻药对兔椎间盘细胞的毒性作用目的：评估临床上常用的三种局麻药(如罗哌卡因、布比卡因及利多卡因)对兔椎间盘细胞活性的影响,并进一步比较这三种局麻药对椎间盘细胞的毒性作用大小。方法：取平面培养的第2代兔纤维环细胞和髓核细胞,分别用不同浓度的局麻药处理,或者同一浓度的局麻药处理不同时间,在相应的时间点,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒评估椎间盘细胞的活性。为了比较不同局麻药对椎间盘细胞的毒性作用,分别采用等效浓度的罗哌卡因、布比卡因及利多卡因处理椎间盘细胞60min,处理完成后采用流式细胞仪检测细胞的活性,并通过相差显微镜观察细胞的形态学改变。此外,通过Hoechst33342和碘化丙啶(PI)双重染色方法,在荧光显微镜下进一步证实椎间盘细胞的凋亡和坏死。结果：布比卡因和利多卡因呈剂量和时间依赖性降低兔椎间盘细胞的活性,而罗哌卡因对椎间盘细胞的毒性作用只具有时间依赖性,与其浓度无明显相关性。此外,利多卡因在三种局麻药中对兔椎间盘细胞的毒性作用最大,布比卡因次之,而罗哌卡因的毒性作用最小。荧光显微镜结果证实,局麻药对椎间盘细胞的短期毒性作用主要是通过诱导细胞发生坏死,而不是凋亡。结论：布比卡因和利多卡因对兔椎间盘细胞的毒性作用具有明显的剂量和时间依赖性。临床上应尽量避免使用局麻药治疗脊柱相关性疼痛；如果一定需要,应优先考虑使用罗哌卡因。局麻药的短期干预导致椎间盘细胞死亡的方式主要为细胞坏死,而不是细胞凋亡。如果本研究结果能在组织块培养模型或者动物实验中得到验证,则提示我们要谨慎使用局麻药来诊断和治疗脊柱相关性疼痛。第二部分RoS介导的溶酶体膜通透性改变在局麻药诱导兔椎间盘细胞死亡中的作用目的：研究临床常用局麻药对兔椎间盘细胞活性的短期影响,并进一步探究局麻药短期干预导致椎间盘细胞死亡的分子机制。方法：取平面培养的第2代兔纤维环细胞和髓核细胞,分别用不同浓度的布比卡因处理60min,在相应的时间点,使用CCK-8试剂盒检测椎间盘细胞的活性。采用流式细胞仪和活/死细胞染色方法检测椎间盘细胞的死亡。利用扫描电子显微镜(TEM)观察布比卡因诱导椎间盘细胞死亡的超微结构改变。通过LysoTracker Red染色评估溶酶体结构的完整性,并用吖啶橙(AO)染色进一步证实溶酶体膜通透性改变(LMP)。此外,采用DCFH-DA荧光染色检测细胞内活性氧(ROS)水平的变化。结果：布比卡因呈剂量和时间依赖性降低兔椎间盘细胞的活性。流式细胞仪和荧光显微镜结果显示,布比卡因对兔纤维环细胞和髓核细胞的短期毒性作用主要是诱导细胞发生坏死。TEM观察到典型的坏死细胞超微结构改变,如细胞器显著肿胀或崩解、胞膜破裂。LysoTracker Red染色和AO染色结果显示,布比卡因能导致兔椎间盘细胞内溶酶体结构发生变化和膜破裂。此外,布比卡因能促进椎间盘细胞内ROS的产生,且通过抗氧化剂NAC抑制ROS水平能部分保护布比卡因诱导的LMP和细胞死亡。结论：体外布比卡因的短期干预能快速地导致兔椎间盘细胞死亡,且细胞的死亡方式主要为坏死。此外,LMP参与布比卡因诱导的椎间盘细胞死亡,且ROS在布比卡因诱导的LMP和细胞死亡中起着重要的作用。未来进一步在体内研究局麻药的毒性作用显得尤为重要。第三部分线粒体途径凋亡参与局麻药诱导的兔椎间盘细胞死亡目的：评估临床常用局麻药对兔椎间盘细胞的长期毒性作用,进一步研究局麻药对椎间盘细胞凋亡的诱导作用及其可能的分子机制。方法：取平面培养的第2代兔纤维环细胞,分别用不同浓度的罗哌卡因和布比卡因处理60min后,再重新将细胞置入新鲜培养基中培养24h和120h。在相应的时间点,利用CCK-8检测试剂盒及EDU染色检测纤维环细胞的增殖能力变化。通过AnnexinV/PI双重染色、Hoechst 33342染色及Caspase-3和Caspase-9活性试剂盒检测纤维环细胞的凋亡情况；使用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blot检测凋亡相关基因的表达；通过JC-1染色评估线粒体膜电位(MMP)的改变。此外,通过DCFH-DA荧光染料检测细胞内ROS的水平。结果：CCK-8及EDU检测的结果显示,罗哌卡因和布比卡因呈剂量依赖性抑制兔纤维环细胞的增殖,且同等浓度的布比卡因较罗哌卡因对细胞增殖的抑制作用更明显。流式检测结果显示,24h时局麻药导致椎间盘细胞死亡的方式主要为坏死,而120h时细胞死亡的主要方式为凋亡。细胞形态学改变、皱缩浓染的细胞核及Caspase-3和Caspase-9活性增加进一步证实纤维环细胞发生凋亡。RT-PCR及Western Blot结果显示,局麻药能促进Bax的表达,而抑制Bcl-2的表达,并引起细胞色素C的释放,进一步激活Caspase-3和Caspase-9.此外,局麻药能显著降低纤维环细胞的MMP并导致细胞内ROS水平升高,抗氧化剂NAC能通过抑制ROS的生成而缓解局麻药引起的MMP改变和细胞凋亡。结论：临床上常用的局麻药对兔椎间盘细胞的长期毒性作用机制主要是通过诱导细胞发生凋亡,而线粒体凋亡途径至少部分参与了局麻药诱导的椎间盘细胞凋亡,未来有必要进一步探究局麻药对椎间盘细胞潜在的毒性作用。