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第一部分:生物信息学分析自噬相关蛋白LC3、Beclin1调控的miRNAs调控网络目的:分析自噬相关蛋白LC3、Beclin1调控的miRNAs调控网络方法:本文通过运用多种生物信息学软件及数据库,确定自噬基因,并探索其相关调控的miRNAs关系,理清这些miRNAs与其上游的转录因子、下游靶基因存在的反馈和前馈通路,以更好理解miRNAs在自噬发生过程中的作用机制,并为下一步实验验证其分子调控网络机制提供线索。结果:通过Pubmed数据库筛选得LC3和Beclin1两个自噬相关基因作为研究对象。利用miRWalk软件分别预测得与LC3相互作用的miRNA共1191个,其中99个miRNA为4个预测软件共同预测所得,从中的10个miRNA与自噬相关;Beclin1与2132个miRNA存在结合位点,其中114个miRNA为4个预测软件共同预测所得,从中17个miRNA参与自噬过程。经文献报道数量比对后,LC3选取miR-140-3p、miR-214-3p和mi R-301a-5p作为候选靶miRNA;Beclin1的靶miRNA为miR-124-3p、miR-21-3p和mi R-30a-5p。Consite软件分别对6个候选miRNA进行转录因子预测,共有46个转录因子分别与6个候选miRNA结合,其中E47A、AML-1、n-AMY、Snail、C-REL、c-FOS、IRF-1、CREB、E2F、NF-κB、p65、NF-Y等12个转录因子参与自噬过程。所有相关基因构成一个调控网络,相互调控,在自噬的发生与发展中扮演起着重要作用。结论:E47A、AML-1、n-AMY、Snail、C-REL、c-FOS、IRF-1、CREB、E2F、NF-κB、p65、NF-Y等12个转录因子分别影响miR-140-3p、miR-214-3p、miR-301a-5p、miR-124-3p、mi R-21-3p、miR-30a-5p的表达,从而实现对LC3和Beclin1的调控,广泛参与自噬的发生与发展当中,为阐明自噬的机制提供新的理论基础,也为后续实验验证提供良好的指导。第二部分:大鼠肝脏撞击伤后肝组织自噬相关蛋白及miRNA的表达目的:研究大鼠肝脏撞击伤后肝组织自噬相关蛋白及miRNA的表达,分析其分子机制。方法:选用清洁级健康雄性SD大鼠60只,随机分为2组(n=30)。通过BIM-V型生物撞击机,以驱动压力200Kpa撞击大鼠肝脏,建立大鼠肝脏撞击伤模型,速率法检测大鼠血清中ALT和AST的活性。ELISA法检测相关细胞因子TNF、IL-8、IL-2的变化情况;HE染色观察组织形态学变化;激光共聚焦显微镜观察自噬小体的形成;Western blotting、免疫组织化学法检测蛋白的表达;RT-PCR检测基因的相对表达水平;生物信息学分析调控LC3、Beclin1的miRNAs;构建双荧光报告基因载体检测基因间的相互结合作用。结果:模型组大鼠血清ALT、AST、TNF、IL-8、IL-2水平较正常组升高,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组大鼠肝组织结构正常,模型组大鼠肝组织出现不同程度损伤,以肝小叶中央静脉为中心的片状坏死,可见多量的坏死细胞;模型组肝组织中LC3、Beclin1的蛋白表达明显增高。mi R-124-3p负性调控Beclin1的表达,mi R-140-3p负性调控LC3的表达。结论:自噬在大鼠肝脏撞击伤后发挥了重要作用,其分子机制可能是mi R-124-3p负性调控Beclin1的表达,mi R-140-3p负性调控LC3的表达。