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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康和生命。越来越多的研究表明,导致肝癌治疗失败及死亡率高的根本原因是肝癌的转移、复发和耐药,而肝癌干细胞在肝癌的转移、复发及耐药中发挥重要作用。因此,靶向肝癌干细胞治疗肝癌有望降低其转移、复发及耐药,提高疗效,降低死亡率。本研究具体内容与结果概括如下：1肝癌干细胞的鉴定目的：探究人肝癌细胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中是否存在肝癌干细胞。方法：采用无血清悬浮培养法和P KH26染色法确定人肝癌细胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中存在肝癌干细胞。运用流式细胞术检测细胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中的干细胞标志物。结果：Bel7402-V13和MHCC97-L细胞经无血清培养均可成为球,成球率分别为55%和22%。该两株细胞经无血清悬浮培养11d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。流式荧光结果显示,在Bel7402-V13细胞中ESA+细胞在sphere细胞中的比例为8.43%,较亲本细胞的2.58%上升了3.4倍；在MHCC97-L细胞中CD90+细胞的比例为3.41%,而在sphere细胞中CD90+细胞比例约为10.3%,MHCC97-L细胞经无血清悬浮培养后,CD90+细胞的比例提升了3.0倍。结论：人肝癌细胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中存在肝癌干细胞,其干细胞标志物分别为ESA和CD90。2抗人肝癌干细胞单抗的筛选与鉴定目的：探讨靶向肝癌干细胞单克隆抗体的生物学特征及其体内外功能。方法：采用流式荧光检测单抗2IA3识别的细胞在Bel7402-V13和MHCC97-L亲本及sphere细胞中的比例。运用双色流式荧光和双色细胞免疫荧光检测单抗21A3识别的抗原与两株细胞的干细胞标志物的共染情况。流式细胞术在Bel7402-V13 sphere细胞中分选出的21A3+、亲本和21A3"细胞后,采用无血清悬浮培养法、transwell实验、CCK8法及小鼠体内致瘤实验,分别检测其成球能力、侵袭能力、耐药能力及动物体内致瘤能力。运用与上述相同的实验方法分别检测单抗21A3对Bel7402-V13和MHCC97-L sphere细胞自我更新能力、侵袭能力和耐药能力的影响。裸鼠体内治疗实验分析单抗21A3联合顺铂对Bel7402-V13移植瘤生长的抑制作用。结果： 首先,在细胞系Bel7402-V13中,我们采用流式荧光检测发现21A3+细胞在sphere细胞中较亲本细胞升高了4倍,表明21A3识别的细胞具有肿瘤干细胞的特征；采用双色细胞免疫荧光和双色流式荧光检测结果发现,单抗21A3识别的抗原分子能与肝癌干细胞标志物ESA共染,表明其可识别肝癌干细胞；将流式分选获得21A3+细胞、亲本细胞和21A3细胞进行成球、侵袭、耐药和裸鼠体内致瘤能力的分析,发现21A3+细胞比2A3-细胞具有更强的成球、侵袭、耐药和体内致瘤能力,证明单抗21A3是一株抗肝癌干细胞的单抗。体外功能研究结果显示,单抗21A3能显著抑制肝癌干细胞的成球和侵袭能力,抑制率分别达到23.9%和50.8%,且能显著降低细胞对顺铂的耐药能力；单抗21A3靶向肝癌干细胞体内治疗实验研究结果显示,停药时,高、低剂量单抗对移植瘤的抑制率分别为71.5%、54.4%,化疗药的抑制率为83.5%,而抗体联合化疗药对移植瘤的抑制率则达到了97%。采用同样的路线和方法,在另一株人肝癌细胞系MHCC97-L中研究单抗21A3的体外功能。流式荧光和细胞免疫荧光检测发现21A3+细胞经无血清培养后可被富集2.2倍。并且单抗21A3可与肝癌干细胞标志物CD90共染,表明单抗21A3可识别肝癌干细胞。体外功能研究结果显示,单抗21A3能显著抑制肝癌干细胞的成球能力、侵袭能力和耐药能力,表明单抗21A3是特异性识别肝癌干细胞的功能性单抗。结论：本研究获得并证明了单抗21A3是一株抗肝癌干细胞的功能性单抗,为肝癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。