【摘 要】
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生命进化和物种分化均需以基因的多样性为基础,对于基因多样性的研究,目前大部分都是通过突变体来进行各类基因功能的研究。在植物中,农杆菌介导的遗传转化被广泛用于产生突变体。突变基因的数量与宿主染色体上插入的T-DNA数量密切相关。目前由于缺乏简单可靠的方法,对一株转化植株是否含有单一拷贝的T-DNA进行鉴定仍是一个挑战。本研究以模式植物--拟南芥为对象,建立了一种基于竞争型PCR检测单拷贝T-DNA插
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生命进化和物种分化均需以基因的多样性为基础,对于基因多样性的研究,目前大部分都是通过突变体来进行各类基因功能的研究。在植物中,农杆菌介导的遗传转化被广泛用于产生突变体。突变基因的数量与宿主染色体上插入的T-DNA数量密切相关。目前由于缺乏简单可靠的方法,对一株转化植株是否含有单一拷贝的T-DNA进行鉴定仍是一个挑战。本研究以模式植物--拟南芥为对象,建立了一种基于竞争型PCR检测单拷贝T-DNA插入的检测方法。主要实验结果如下:（1）Real-time PCR不能准确鉴定转基因植株中的单拷贝T-DNA插入。以单拷贝内源基因组片段Pro HTR10为内参,通过Real-time PCR评估了单拷贝T-DNA（包含一个GFP基因）插入杂合转基因植株seb19-L中Pro HTR10和GFP片段的比值,三次独立实验显示其平均比值为3.43:1。与预期比值（2:1）相比,该实验结果（3.43:1）使我们无法确定转基因植株中的T-DNA为单拷贝插入。（2）竞争型PCR能检出DNA样本中的单拷贝T-DNA插入。对组装得到目标和竞争模板为1:1的DMG&DG质粒与目标和竞争模板为2:1的2×DMG&DG质粒分别进行竞争型PCR,实验结果显示上带与下带的平均灰度比分别为0.88:1和1.35:1,表明竞争型PCR可以识别单拷贝插入的DNA样本。（3）竞争型PCR能检出转基因植物中的单拷贝T-DNA插入。通过杂交,我们获得了目标和竞争模板为1:1（B5/-&M2/-和B8/-&M3-）和2:1（B5/B5&M2-和B8/B8&M3/-）的转基因株系,并对其基因组DNA进行了竞争型PCR。结果显示:以B5/-&M2/-及B8/-&M3-基因组DNA为模板进行竞争型PCR时,其两PCR产物的平均灰度比值分别为0.86:1及0.85:1;以B5/B5&M2及B8/B8&M3/-基因组DNA为模板进行竞争型PCR时,其平均灰度比值为1.39:1及1.28:1。这些实验结果表明竞争型PCR可以用来检测转基因植株中的单拷贝T-DNA插入。（4）通用竞争子BHK-的构建。竞争型PCR能被广泛地用来检测转基因植株中单拷贝T-DNA插入的前提是其拥有一个适用于绝大多数转基因植物的通用竞争子。考虑到几乎所有的转基因植物都包含卡那霉素、潮霉素或除草剂抗性基因,我们因此构建了一个包含上述三个抗性基因片段的通用竞争子BHK-。利用质粒BHK-&BHK+（目标与竞争模板之比为1:1）和BHK-&2×BHK+（目标与竞争模板之比为2:1）为模板的竞争型PCR显示:其两PCR产物的灰度比分别为0.8～0.9:1及1.2～1.3:1,表明BHK-能被用来作为一个通用竞争子。（5）包含单拷贝通用竞争子BHK-的转基因植物BHK--1的构建。为获取适用于大多数转基因植株检测的通用竞争转基因植株,我们构建了一个包含BHK-&Pro RPS5A:H2B-td Tomato融合片段的T-DNA质粒,并通过荧光显微术筛选（Pro RPS5A:H2B-td Tomato融合基因使转基因植物的细胞核呈现红色荧光）获得了多株稳定转化植株BHK-。利用竞争型PCR扩增BHK-与seb19-L杂交植物的基因组,我们分离得到了一株仅包含BHK-&Pro RPS5A:H2B-td Tomato单拷贝插入的转基因植物,并将其命名为BHK--1。（6）对照转基因植株BHK±1:1,BHK±2:1,BHK±3:1的构建。为消除两PCR产物之间的比值在不同实验条件下的差异,我们产生了目标BHK+和竞争子BHK-比例为1:1,2:1,3:1的对照转基因植株BHK±1:1,BHK±2:1,BHK±3:1。通过比较这些对照转基因植株与测试植株之间的两竞争型PCR产物之间的比值,我们能够更准确地判断测试植株中的T-DNA插入数目。
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