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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）作为常见二类动物疫病,在世界范围内广泛流行,严重制约着世界生猪养殖业的发展。由于其病原伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）具有隐性感染以及神经嗜性等特性,一直难以得到根除。借鉴欧美地区伪狂犬病根除案例,我国于上世纪80年代引进匈牙利Bartha-K61疫苗进行伪狂犬病根除计划,伪狂犬病在我国得到有效控制。但自2011年末以来,国内多地经Bartha-K61疫苗免疫猪场相继爆发伪狂犬病疫情,分离鉴定发现病原为伪狂犬病毒突变株,致病性更强,呈现出新一轮伪狂犬病流行趋势。目前应用的PRV疫苗对伪狂犬病毒新流行毒株的感染不能提供完全保护,因此大量学者已开始针对伪狂犬病毒新流行毒株进行疫苗研究。本研究以实验室前期构建的标记有绿色荧光蛋白基因（EGFP）的g I/g E缺失毒株r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+为材料,利用同源重组原理在r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+基因组g I/g E缺失位置插入g B外源表达盒序列,筛选出高效表达g B基因的重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+,并在昆明小鼠体内评估其免疫原性。主要研究内容如下:1.重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+的构建与生物学特性分析实验室前期分离得到国内PRV新流行毒株PRV-AH-China-2013（以下简称PRV-AH）,并构建了g I/g E缺失毒株r PRV-AH-g I-/g E-和r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+。在此基础上,本研究扩增g B编码区序列并在3’末端标记His标签序列,克隆到哺乳动物真核表达质粒p CDNA3.0多克隆位点上,然后扩增得到g B外源表达盒序列CMV-g B-SV40 poly A,并克隆至前期构建的g I/g E同源臂质粒p MD-LA-RA,获得重组质粒p MD-LA-g B-RA。通过脂质体转染法将质粒转染到BHK-21细胞,并侵染病毒r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+,待二者在BHK-21细胞中充分同源重组后,结合空斑纯化与极限稀释法,筛选获得重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+。PCR测序结果显示g B外源表达盒序列成功插入到预期位置。连续传代15次后,g B外源表达盒序列依旧在重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+基因组中稳定遗传,未发生缺失突变。对重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+进行生长动力学分析,并与相关亲本毒株r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+和PRV-AH进行比较,发现三者生长动力学基本一致,无明显差异,三者的最高TCID50分别为10-8.57/m L、10-8.44/m L和10-8.69/m L。采用实时荧光定量PCR及Western Blot检测重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+中g B基因的表达情况,并与r PRV-AH-g I-/g E-进行比较。实时荧光定量PCR结果显示,g B外源表达盒序列在r PRV-AH-g I-/g E-/g B+基因组上高效转录,在病毒感染BHK-21细胞能显著提高g B m RNA表达水平,24 h后,其表达水平为r PRV-AH-g I-/g E-中g B m RNA表达水平的29.24倍。Western Blot结果显示,g B-His融合蛋白在BHK-21细胞中可高效表达,大小为117 k D,与预期大小一致。2.r PRV-AH-g I-/g E-/g B+灭活疫苗对昆明小鼠的免疫效力评价用甲醛灭活病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+后,与MONTANIDE GEL 01按比例混合制备灭活疫苗,免疫昆明小鼠及攻毒,并与r PRV-AH-g I-/g E-灭活疫苗、商品化灭活疫苗进行对比,评价其免疫效力。免疫方案选取105TCID50、106TCID50两个不同的免疫剂量,首次免疫4周后加强免疫一次,定期采血,测定小鼠血清中和抗体水平。二免后4周以新流行毒株PRV-AH进行攻毒实验,评价疫苗的免疫保护效果。中和实验结果显示,r PRV-AH-g I-/g E-/g B+灭活疫苗免疫组小鼠血清中和抗体水平在二免后迅速升高,二免后3周达到峰值;105TCID50、106TCID50免疫剂量组之间中和抗体水平存在显著差异（p<0.05）,106TCID50为小鼠优选免疫剂量;106TCID50免疫剂量组中,r PRV-AH-g I-/g E-/g B+免疫组小鼠血清中和抗体在二免后3周达到1:81.85,显著高于r PRV-AH-g I-/g E-免疫组（1:53.24）（p<0.05）,商品化疫苗组在二免后4周达到1:77.87,中和抗体水平与r PRV-AH-g I-/g E-/g B+免疫组相当,初步表明g B基因表达量的增加显著提高了病毒的免疫原性。小鼠攻毒实验结果显示,106TCID50疫苗免疫组未出现小鼠死亡情况,三者均能对小鼠提供100%的保护率,可完全抵抗致死剂量PRV强毒株的感染;105TCID50免疫剂量组中,r PRV-AH-g I-/g E-/g B+灭活疫苗对小鼠的保护率为75%,r PRV-AH-g I-/g E-灭活疫苗对小鼠的保护率为87.5%。综上所述,r PRV-AH-g I-/g E-/g B+具有良好的免疫原性,并对PRV流行毒株的感染起到高效的免疫保护效果,可进一步在猪体内评估其免疫效力,评价其作为伪狂犬病候选疫苗株的发展前景。