农杆菌介导蛹虫草多糖生物合成关键酶基因的克隆与表达

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蛹虫草是一种具有极高营养价值的可食用真菌,因其包含有多种活性物质,被广泛运用于医药行业。蛹虫草多糖是其最主要的活性化学成分之一,发挥着调节免疫,抗肿瘤,抗炎,抗氧化,抗衰老,降血糖等多种生物功能。由于传统的多糖提取受限于原料供应不稳定、多糖产物含量低等问题,研究蛹虫草多糖的增产具有极大的市场价值。目前,蛹虫草多糖主要从发酵液、菌丝体及子实体中获得,研究增加产量的方向多集中在如何改善培养条件及提取工艺上,但如何定向地改良蛹虫草菌株的研究尚属欠缺。本研究主要通过分子水平操作来调控多糖合成代谢过程中相关酶的表达来研究这些酶系在多糖合成代谢中的作用。本课题通过构建重组质粒,采用根癌农杆菌转化法(ATMT)使得蛹虫草多糖代谢途径中的关键酶半乳糖激酶(GALK1)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(GALT)的基因在蛹虫草原生质体内过表达,通过Western-Blot检测目的基因在重组型菌株内的表达量,并对蛹虫草多糖产量,单糖组成及蛹虫草多糖合成途径中相关酶活进行研究。研究成果主要有:1.查阅KEGG数据库,查找编码蛹虫草菌株中半乳糖激酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因序列。以CDS序列设计引物,提取的蛹虫草c DNA作为模板,聚合酶链式反应扩增目的基因gallk1和galt。p CAMBIA1302质粒载体线性化,同源重组构建重组质粒PJW-GALK1和PJW-GALT,重组质粒转化根癌农杆菌,筛选出加载有目的基因gallk1和galt的农杆菌菌株。通过根癌农杆菌介导转化蛹虫草原生质体,从含有潮霉素和卡那霉素的平板中筛选出重组型蛹虫草菌株。2.研究发现重组型蛹虫草菌株PJW-GALK1和PJW-GALT的生物量与野生型相比有较大的提高,而且重组型菌株的还原糖消耗速度加快。在整个代谢过程中,重组型菌株的多糖产量明显高于野生型蛹虫草菌株。在对发酵过程中多糖组成及比例变化进行研究时发现,由于galk1、galt基因的过表达,半乳糖的组分明显增多。3.运用Western-Blot定性检测参与核苷酸供体重要酶的表达发现,由于galk1、galt基因的过表达,使得半乳糖激酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的表达量增加,而且两种酶的比酶活也明显高于野生型。本研究通过农杆菌介导合成蛹虫草多糖生物合成关键酶——半乳糖激酶,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶,并验证其在多糖产量,比酶活方面与野生型蛹虫草间的差异,用以研究其在蛹虫草多糖生物合成中的重要作用,并且为蛹虫草多糖生物合成的研究提供了新的研究思路。
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