背景:　　 世界范围内的恶性肿瘤发病率和死亡率呈上升趋势，如何遏制恶性肿瘤已成为世界医学界的难题。随着肿瘤治疗手段不断的改善，肿瘤疫苗成为当今研究的热点。肿瘤疫苗是一种治疗性的，新型的肿瘤治疗方法，也是一种主动性免疫疗法。与传统的治疗方法比较，其作用范围更加广泛，无明显的毒副作用，特异性高，在恶性肿瘤的治疗中显示了独特的优势。　　 目的:　　 本文在已成功构建的MIP-3α-SA-PET21重组表达质粒的基础上，通过大肠杆菌的表达，镍柱亲和层析纯化，尿素梯度透析复性等一系列方法，研究其最佳表达，纯化及复性的条件；大量制备链亲合素(SA)标记的MIP-3α融合蛋白MIP-3α-SA，并研究其生物学活性及功能，为进一步的肿瘤疫苗的研制及药物的临床前研究奠定基础。　　 方法:　　 1．诱导表达MIP-3α-SA融合蛋白　　 用传统的CaCl2方法制备Rosetta感受态细胞，首先从大肠杆菌DH5α(由本室保存)含质粒MIP-3α-SA-PET21中提取目的质粒，将该质粒转化入感受态细胞中进行过夜活化，扩大培养，IPTG诱导表达，高压细胞破碎仪破碎菌体，包涵体洗涤液洗涤包涵体，应用SDS-PAGE分析上清及包涵体表达产物。　　 2．MIP-3α-SA融合蛋白表达条件的优化　　 通过调整IPTG诱导剂的浓度和诱导时间，应用SDS-PAGE分析结果，筛选最优的诱导条件；比较超声细菌破碎仪和高压细菌破碎仪(加入溶菌酶)两种方法的效果，应用SDS-PAGE分析，筛选最优菌体破碎条件。　　 3．包涵体洗涤、纯化，复性　　 收集高压破碎后包涵体，应用本室成功研制的包涵体洗涤方法进行洗涤；包涵体经过洗涤后用8M尿素溶解，进行镍柱亲和层析纯化；通过尿素梯度透析复性，得到融合蛋白；应用免疫印迹和银氨染色等方法进行验证；应用BandScan软件对纯化后、复性后蛋白SDS-PAGE电泳图，银氨染色电泳图进行软件分析；此外测定复性后蛋白的浓度并探索其稳定的保存方法。　　 4．趋化实验和细胞锚定实验　　 将复性的MIP-3α-SA融合蛋白调整不同浓度体外检测其是否对人淋巴细胞有趋化效应，并研究其是否有剂量依附关系；应用流式细胞仪检测MIP-3α-SA融合蛋白对前列腺癌细胞RM-1的锚定率，初步评价经纯化复性后MIP-3α-SA融合蛋白的生物学活性。　　 结果:　　 1．诱导表达MIP-3α-SA融合蛋白　　 将质粒MIP-3α-SA-PET21导入大肠杆菌中，在带有氯霉素和氨苄霉素抗性的平板中，经过37℃，24h孵育后生长出单克隆菌落；挑取菌落过夜活化，37℃，220rpm，0.5mmol/LIPTG条件下诱导表达4h，经SDS-PAGE鉴定蛋白出现约31KD大小位置；经BandScan软件分析，MIP-3α-SA目的蛋白约占总蛋白30％；表达菌通过破碎后，目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。　　 2．MIP-3α-SA融合蛋白表达条件的优化　　 经过SDS-PAGE鉴定，IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导时间在5h为最佳诱导条件；加入溶菌酶高压破碎处理后的电泳效果较之未加溶菌酶的超声破碎效果佳，因此样品与菌体按1:20(w/v)重悬于PBS缓冲液，1:500溶菌酶(200mg/ml)，冰盒中作用30min，高压破碎2次(1000MPa)，为最佳破菌条件。　　 3．包涵体洗涤、纯化，复性　　 洗涤液洗后的包涵体用8M尿素溶解后，经镍柱亲和层析纯化，目的蛋白在75mmol/L处洗出；经尿素梯度透析复性后，融合蛋白的非还原状态主要以多聚体的形式存在；纯化复性后的目的条带经SDS-PAGE，免疫印迹和银氨染色分析，经BandScan软件分析纯度为95％；我们进一步研究出较为稳定的蛋白质样品的保存方法。　　 4．趋化实验和细胞锚定实验　　 分离人血淋巴细胞，体外趋化实验检测发现不同浓度的MIP-3α-SA有趋化人血淋巴细胞的活性且成剂量依赖效应；流式细胞仪检测MIP-3α-SA融合蛋白与经生物素化的RM-1肿瘤细胞锚定率达到99.7％。　　 结论:　　 本文成功的将MIP-3α-SA-PET21质粒导入大肠杆菌中并通过诱导表达方法获得大量工程菌和包涵体。通过镍柱亲和层析纯化，尿素梯度复性后获得高浓度和高纯度的融合蛋白，并在体外人淋巴细胞趋化实验和细胞锚定实验中初步证实了MIP-3α-SA双功能融合蛋白的生物学活性。本实验为后续的肿瘤疫苗的体内生物学作用以及临床前研究奠定了基础。