【目的】本研究利用大鼠脑缺血再灌注(I/R)模型和无创性延迟肢体缺血预适应(NDLIP)模型,探索线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)和线粒体渗透性转换孔(mPTP)在NDLIP对抗大鼠脑I/R损伤中的作用,观察NDLIP在脑I/R损伤后对缺血区皮层线粒体膜电位及氧化呼吸链酶复合体活性的影响,探讨NDLIP对抗脑I/R损伤的线粒体相关机制。【方法】健康的雄性Wistar大鼠随机分成9组。(1)Sham组:取颈正中切口,分离颈部肌肉组织,暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,游离左侧颈总动脉,但不夹闭。(2)I/R组:建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,实施缺血1h/再灌注24h。(3)NDLIP组:每天实施左后肢缺血5min/再灌注5min,循环3次,连续3天,第4天建立MCAO模型,脑缺血1h/再灌注24h。(4)DIA组:尾静脉注射mitoKATP开放剂二氮嗪(Diazoxide,DIA)5mg/kg(溶解于0.1M Na OH溶液,注射剂量为0.6ml),30 min后建立MCAO模型,脑缺血1h/再灌注24h。(5)NDLIP+5-HD组:左后肢实施3次5min缺血/5min再灌注,每天1次,连续3天,第4天尾静脉注射mitoKATP抑制剂5-羟基喹酸盐(5-Hydroxydecanoate sodium,5-HD)10mg/kg(溶解于0.9%生理盐水,注射剂量为0.6ml),30 min后建立MCAO模型,对脑实施1h缺血/24h再灌注。(6)Na OH组:尾静脉注射0.1M Na OH溶液0.6ml,30 min后建立MCAO模型,对脑实施1h缺血/24h再灌注。(7)NDLIP+Atr组:左后肢实施3次5min缺血/5min再灌注,每天1次,连续3天,第4天侧脑室注射m PTP开放剂苍术苷(atractyloside,Atr)10ul(3m M,溶解于0.9%生理盐水),30 min后建立MCAO模型,对脑实施1h缺血/24h再灌注。(8)Cs A组:侧脑室注射mPTP抑制剂环孢素A(Cyclosporin A,Cs A)10ul(3u M,溶解于0.9%生理盐水),30 min后建立MCAO模型,对脑实施1h缺血/24h再灌注。(9)NS组:侧脑室注射0.9%生理盐水(normal saline,NS)10ul,30 min后建立MCAO模型,对脑实施1h缺血/24h再灌注。大鼠实施1h缺血/24h再灌注后进行行为评分观察神经功能变化,TTC染色法测定脑梗死面积,Western Blot法检测皮层Bax、Bcl-2和Caspase 3蛋白含量,提取缺血区皮层脑组织线粒体,jc-1探针检测线粒体膜电位,比色法测定线粒体氧化呼吸连酶复合体i、ii和iv的活性。【结果】1、大鼠左侧大脑中动脉缺血1h再灌注24h后,与i/r组(2.2±0.7)相比,ndlip组(1.0±0)、dia组(1.0±0)和csa组(1.0±0)大鼠的行为评分明显降低(p<0.01);与ndlip组比较,ndlip+5-hd组(1.8±0.7)、naoh组(2.2±0.7)、ndlip+atr组(2.0±1.0)和ns组(2.3±0.7)大鼠的行为评分显著升高(p<0.01)。2、大鼠左侧大脑中动脉缺血1h再灌注24h后,sham组未见梗死区域,与i/r组(17.94%)相比,ndlip组(10.88%)、dia组(10.35%)和csa组(9.91%)大鼠的脑组织梗死面积明显降低(p<0.01);与ndlip组比较,ndlip+5-hd组(19.18%)、naoh组(18.52%)、ndlip+atr组(18.24%)和ns组(19.29%)大鼠的脑组织梗死范围显著升高(p<0.01)。3、大鼠左侧大脑中动脉缺血1h再灌注24h后,与sham组相比,受到脑i/r损伤的大鼠缺血区皮层脑组织的bax、caspase3表达增多,bcl-2表达降低,具有非常显著性差异(p<0.01);与i/r组比较,ndlip组、dia组和csa组的bax表达显著下降(p<0.01),caspase3表达明显降低(p<0.01),而bcl-2表达则相对增高(p<0.01);与ndlip组比较,ndlip+5-hd组、naoh组、ndlip+atr组和ns组的bax表达显著增高(p<0.01),caspase3表达明显增加(p<0.01),而bcl-2表达则相对降低(p<0.01)。4、大鼠左侧大脑中动脉缺血1h再灌注24h后,与sham组(171.97±5.20)相比,受到脑i/r损伤的大鼠线粒体膜电位明显降低(p<0.01),与i/r组(83.28±3.65)相比,ndlip组(116.18±3.45)、dia组(112.50±5.02)和csa组(110.48±5.31)大鼠的线粒体膜电位明显升高(p<0.01),与ndlip组比较,ndlip+5-hd组(86.55±2.70)、naoh组(81.58±2.60)、ndlip+atr组(80.41±9.28)和ns组(85.17±3.54)大鼠的线粒体膜电位显著降低(p<0.01)。5、大鼠左侧大脑中动脉缺血1h再灌注24h后,与sham组相比,受到脑i/r损伤的大鼠缺血区皮层脑组织的线粒体呼吸链酶复合体i、复合体ii和复合体iv活性降低(p<0.01);与i/r组比较,ndlip组、dia组和csa组的复合体i、复合体ii和复合体iv活性升高(p<0.01);与ndlip组比较,5-hd组、naoh组、atr组和ns组的复合体i、复合体ii和复合体iv活性降低(p<0.01)。【结论】1、NDLIP能够促进mitoKATP通道的开放,抑制mPTP开放,减小脑I/R损伤后脑梗死面积,改善神经功能障碍,起到脑保护作用。2、I/R损伤后,损伤半球脑组织中的Bcl-2表达受到抑制,Bax和凋亡蛋白酶caspases 3含量升高,Bcl-2/Bax降低,表明I/R损伤后,由Bcl-2家族蛋白调节的线粒体相关的凋亡通路被激活,而NDLIP能够明显抑制这一凋亡信号通路,其机制可能是通过促进mitoKATP通道的开放,抑制mPTP开放,起到抗凋亡的作用。3、脑I/R损伤后,NDLIP能够维持损伤区皮层线粒体膜电位,提高I/R损伤后损伤区大脑皮层线粒体氧化呼吸链酶复合体I,复合体II和复合体IV的活性。其机制可能是通过促进mitoKATP通道的开放,抑制mPTP开放,从而直接或者间接的增强了线粒体氧化呼吸链抵抗氧化损伤的能力。