目的研究重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞是否具有增殖抑制作用,为临床肿瘤药物的筛选提供研究依据。材料和方法(1)人脑胶质瘤细胞株(U251,购自南京凯基生物科技发展有限公司)采用高糖DMEM培养液培养,待细胞长至75%～90%密度时,用0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶消化,按1：3-4传代。(2)取对数生长期的人脑胶质瘤细胞,调整细胞浓度为5～10×104/ml,接种于96孔培养板,并分别加入不同终浓度为50、100、150ng/ml的重组人血管内皮抑制素,每孔0.1ml,培养24h后,每孔分别加入0.5～lmg/mlMTT液1001μl,作用4h后终止培养,将上清液吸出后每孔各加入二甲基亚枫150μl,振荡溶解10分钟,490nm波长下测各标本吸光度。(3)盖玻片放入6孔板中,胶质瘤细胞以5×106/ml接种培养,48小时后更换培养液,然后更换为含有重组人血管内皮抑制素的培养液,用4%多聚甲醛缓冲液固定,在37℃条件下用Fluo-3避光负载30min。应用Bio-Red Radiance 2100型激光扫描共聚焦显微镜操作系统的Ar离子激光系统,扫描用Fluo-3标记的胶质瘤细胞。(4)胶质瘤细胞分别加入含有重组人血管内皮抑制素的培养液,并设一对照组,继续培养24小时,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,70%的冷乙醇固定24h。离心去除固定液,加入碘化丙啶染色。采用FACSCalibur型流式细胞仪对样品进行检测用氩离子激发器激发波长488nm波,分析PI荧光直方图上凋亡细胞百分率。结果(1)脑胶质瘤细胞的形态学特征倒置显微镜下观察培养的细胞可见人脑胶质瘤细胞的形态呈多样性,大小不一,胞体向四周伸出突起,胞质内可见圆形透亮分泌颗粒。经重组人血管内皮抑制素作用48h后,可见细胞形态收缩变圆,聚集成团,部分细胞破碎,以坏死细胞为主。(2)MTT法测定细胞增殖抑制率重组人血管内皮抑制素各实验组的吸光光度值均较对照组值小。对照组的吸光光度值0.302±0.012,50ng/ml、100Ong/ml、150ng/ml分别为0.284±0.006、0.218±0.014、0.175±0.012,比较有统计学意义(P<0.05)。(3)激光共聚焦显微镜对细胞内Ca2+的测定各实验组Ca2+(37.36±3.05、51.47±3.12、64.41±3.01)与对照组(23.21±2.18)的胶质瘤细胞相比,经重组人血管内皮抑制素作用后的细胞内的游离Ca2+的荧光强度明显增强。图像分析显示钙离子的浓度逐渐增加,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)流式细胞仪分析结果显示重组人血管内皮抑制素可阻滞细胞周期于G0/G1期,出现明显的凋亡峰,S期细胞数减少。结论重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞有明显的抑制作用,且具有剂量依赖性,能抑制人脑胶质瘤细胞增殖,为使该药可能成为一种间质治疗药物提供了基础研究依据。