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研究背景冠状动脉粥样硬化(AS)是造成急性冠脉综合征(ACS)的主要原因,导致大多数心血管事件的发生。它是动脉壁的一种慢性炎症性疾病,血管内皮细胞功能障碍在动脉粥样硬化的早期起着关键作用,过量的脂质和炎症反应被认为是斑块形成的主要因素。受累动脉病变先是内皮功能障碍、然后内膜内广泛的脂质沉积,吞噬细胞和血小板粘附、聚集以及炎性因子的释放造成炎症反应。PECAM-1在内皮细胞表面有表达,尤其血管内皮细胞连接部位高度表达,有研究认为PECAM-1在动脉粥样硬化的发病机制中发挥作用,其作为内皮细胞表面机械感受器调节细胞功能的变化。氧化应激引起的活性氧(ROS)产生是许多血管疾病的重要原因。ROS主要由NADPH氧化酶产生,在生理条件下,血管NADPH氧化酶具有较低的活性。然而,NADPH氧化酶含量可以在脂多糖(LPS)等刺激物的作用下得到提高,诱导内皮细胞功能改变,引起炎症反应,破坏血管稳态。PARP-1是一种高度保守的DNA结合核酶,在氧化应激DNA损伤时被激活,PARP-1可以调节各种关键炎症因子的表达,包括细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)等。PARP-1抑制剂可保护内皮功能,减少炎症和动脉粥样硬化斑块大小。研究目的研究血管内皮细胞表达的PECAM-1在动脉粥样硬化中的作用,验证NOX/ROS参与PECAM-1调节PARP-1的作用。研究方法1.为了验证PECAM-1在无LPS刺激的情况下是否调控NOX4、PARP-1及炎性因子的表达,将内皮细胞分为control组和PECAM-1 siRNA组,control组不做任何干预,PECAM-1 siRNA组转染PECAM-1的小干扰RNA,在CO2培养箱中培养24 h。2.为了验证PECAM-1在LPS刺激的情况下是否调控PARP-1及炎性因子的表达,将内皮细胞分为control组和LPS组,control组不做任何干预,LPS组给予0.5 ug/ml LPS刺激,在CO2培养箱中培养24 h。3.为了验证PECAM-1在无NOX4参与的情况下是否表达PARP-1及炎性因子,将内皮细胞分为control组和Apocynin组,control组不做任何干预,Apocynin组先加入NOX4的抑制剂Apocynin,1 h后给予0.5 ug/ml LPS刺激,在CO2培养箱中培养24 h。4.为了验证PARP-1是否促进下游炎性因子的表达,将内皮细胞分为control组、LPS组、DPQ组,control组不做任何干预,LPS组给予0.5 ug/ml LPS刺激,DPQ组先加入PARP-1抑制剂DPQ,1 h后给予0.5 ug/ml LPS刺激,在CO2培养箱中培养24 h。5.验证抑制PECAM-1看能否减轻LPS诱导的炎症反应(减少PARP-1及炎症信号的表达)。将内皮细胞分为control组和PECAM-1 si RNA+LPS组,control组不做任何干预,PECAM-1 si RNA+LPS组转染PECAM-1的小干扰RNA,1 h后给予0.5 ug/ml LPS刺激,在CO2培养箱中培养24 h。实验结果流式结果分析显示:LPS组进入细胞的DCFDA荧光探针为54.9%,control组进入细胞的DCFDA荧光探针为33.4%,两组相比较,LPS组ROS表达量明显较高;PECAM-1 si RNA组进入细胞的DCFDA荧光探针为24.0%,control组进入细胞的DCFDA荧光探针为20.7%,两组相比较,ROS表达量无明显差异。细胞免疫荧光结果显示:LPS组与control组比较,NOX4蛋白表达量较高;PECAM-1si RNA组与control组比较,NOX4表达量无明显差异Western blot及ELISA结果显示:LPS组(0.430±0.019)与control组(0.232±0.030)比较,PARP-1蛋白的表达明显较高(P<0.05);LPS组(1768±39.75)与control组(829.7±18.67)比较,炎性因子VCAM-1的表达明显较高,LPS组(14.05±1.15)与control组(3.28±0.31)比较,炎性因子ICAM-1的表达明显较高,LPS组(1909±32.16)与control组(1352±109.8)比较,MCP-1的表达明显较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Apocynin组(0.093±0.006)与control组(0.088±0.005)比较,PARP-1蛋白的表达量无明显差异(P>0.05),炎性因子VCAM-1的表达量Apocynin组(650.8±64.74)与control组(591.0±26.57)比较,ICAM-1的表达量Apocynin组(4.007±0.95)与control组(2.893±0.51)比较均无明显差异(P>0.05)。PECAM-1 si RNA组(0.065±0.011)与control组(0.065±0.013)比较,PARP-1的表达无明显差异(P>0.05);PECAM-1 si RNA组(786.2±54.8,3.283±0.31)与control组(728.4±25.59,2.73±0.32)比较,VCAM-1及ICAM-1表达无明显差异(P>0.05)。PECAM-1 si RNA+LPS组(0.105±0.008)与control组(0.108±0.008)比较PARP-1蛋白的表达量无明显差异(P>0.05),炎性因子VCAM-1的表达量PECAM-1 si RNA+LPS组(709.50±67.89)与control组(664.70±37.84)比较无明显差异,ICAM-1的表达量PECAM-1 si RNA+LPS组(3.44±0.34)与control组(3.54±1.14)比较无明显差异(P>0.05)。DPQ组(962.6±23)与LPS组(1768±39.75)比较明显减少,ICAM-1的表达量DPQ组(669.9±20.82)与LPS组(1181±34.70)比较明显减少,MCP-1的表达量DPQ组(1519±32.16)与LPS组(1909±32.16)比较明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。LPS组(0.407±0.023)与control组(0.220±0.015)、Apocynin组(0.247±0.028)比较,PECAM-1的表达量较高。研究结论1.LPS能增加血管内皮细胞活性氧表达,促进DNA修复酶PARP-1表达和炎症因子的产生,提示氧化应激作为AS发病的重要诱发因素促动脉粥样硬化形成。2.NOX/ROS参与PECAM-1/PARP-1对血管内皮细胞功能的调节,可能是LPS诱发动脉粥样硬化的一个重要作用机制。