神经元凋亡引起的神经元丢失是神经退行性疾病如帕金森病和老年性痴呆症的重要病理特征。阐明对神经元凋亡起关键性作用的蛋白质的信号转导及其调控机制，对揭示神经退行性疾病发生的本质并寻找、确立药物靶点，从而进一步达到有效防治神经退行性疾病的目的，具有重要意义。 小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons，CGNs)是哺乳动物脑中丰富的中枢神经元。体外培养CGNs时，去极化浓度的KCl(25mmol/L，25K)可以维持小脑颗粒神经元的存活分化、和成熟，而复极化浓度的KCl(5mmo/L，5K)培养基可诱导分化成熟的小脑颗粒神经元凋亡。由于小脑颗粒神经元来源丰富、体外培养的同质性高，所以此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究。 GSK-3β(glycogen synthase kinase-3β)是神经元凋亡的关键性激酶，是多种促神经元存活信号干预神经元凋亡的关键性靶位。目前，多数文献报道GSK-3β活性主要受自身N-末端磷酸化水平的调控，Ser9磷酸化的N-末端具有竞争性抑制GSK-3β活性的作用。最近，我们观察到，小脑颗粒神经元凋亡时，GSK-3β除了出现Ser9磷酸化水平降低之外，还发生了蛋白切割，而蛋白切割是神经元凋亡时的一种重要调控机制。这些观察提示，GSK-3β不仅通过Ser9去磷酸化，而且还可能通过蛋白切割这一方式来调控神经元的凋亡。 因此,本课题主要研究以下内容: 1、GSK-3β是否为撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡所必需? 2、什么蛋白酶介导了GSK-3β的切割? 3、GAK-3β的切割发生在哪一端? 实验方法和结果： 一、GSK-3β为撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡所必需 1.抑制GSK-3β对撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡具有保护性干预作用。 为了观察GSK-3β是否促神经元凋亡，我们首先采用了抑制剂实验。小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别给予25K、5K、5K+SB415286(50μM)、5K+AR-A014428(10μM)、5K+CT99021(0.4μM)等处理。12小时后，加入Hoechst33258(5μg/ml)进行活细胞染色以观察核形态，倒置荧光显微镜(200×)观察并拍照计算凋亡率。结果表明GSK-3抑制剂可以保护性干预神经元凋亡。 为排除抑制剂的非特异作用，我们采用GSK-3β的负显性质粒K85R来抑制GSK-3β的活性。将K85R和GFP共转染神经元，36小时之后，换成25 K、5 K培养基处理12小时，Hoechst 33258染色，计算GFP标记的神经元凋亡率。结果表明：K85R能够有效地保护神经元。 为了排除以上2种方法对GSK-3α的非特异作用，我们构建了GSK-3β小分子干扰片段shGSK-3β-a、shGSK-3-b特异有效地干扰神经元内源性GSK-3β的表达。将这些小分子干扰片段转染神经元，48小时之后，换成25K、5K培养基处理12小时，Hoechst 33258染色，计算GFP标记的神经元凋亡率。结果显示小分子干扰片段shGSK-3β-a、shGSK-3β-b能够明显地降低神经元的凋亡率。 以上分别通过抑制剂、负显性和小分子干扰的方法逐层递进地阐明：抑制GSK-3β可以保护神经元。 2.组成性激活的GSK-3β诱导小脑颗粒神经元凋亡。 为了从另一个角度观察GSK-3β对神经元凋亡的影响，我们进一步观察了GSK-3β的组成性激活质粒S9A对神经元的作用。体外培养第5天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法共转染pCMV-EGFP与pcDNA3.1或pcDNA3.1-GSK-3β—S9A—V5质粒(简称为S9A)。质粒在细胞内表达36小时，换25K、5K模型。12小时后，Hoechst 33258进行核染色，倒置荧光显微镜(200×)观察并拍照计算凋亡率。结果显示组成性激活的GSK3β可以诱导神经元凋亡。 上述结果强烈支持GSK-3B是小脑颗粒神经元凋亡所必需，那它参与神经元凋亡调控的机制是什么呢? 二、神经元凋亡时calpain切割GSK-3β 1.GSK-3β在小脑颗粒神经元凋亡过程中被切割。 为了阐明GSK-3β调控神经元凋亡的机制，我们首先观察了神经元凋亡过程中GSK-3β蛋白表达水平的变化。小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别给予25K、5K处理4小时、8小时、12小时和16小时后，收集细胞总蛋白，在8％的SDS-PAGE凝胶内进行分离；使用识别GSK-3β中间区域(345—420aa)的抗体进行Western Blot检验，可见随凋亡诱导时间增加，GSK-3β逐渐被切割，产生3种可被抗体识别的产物：t-GSK-3β(Truncated GSK-3)1，2,3。结果表明GSK-3β在小脑颗粒神经元凋亡过程中被切割。 2.Calpain介导小脑颗粒神经元凋亡时GSK-3β的切割。 为了明确何种蛋白酶介导了GSK-3β的切割，我们观察了不同蛋白酶抑制剂对GSK-3β切割的抑制效果。小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别给予25K、5K、5K+25 gM ALLM(calpain抑制剂)、5K+10 μM Z-VAD(caspase抑制剂)处理16小时后，收集细胞总蛋白，在8-12％的SDS-PAGE凝胶内进行分离；使用识别GSK-3β中间区域(345-420 aa)和caspase-3的抗体进行Western Blot检验，可见小脑颗粒神经元凋亡时GSK-3β被切割，产生3种可被抗体识别的产物，calpain的抑制剂ALLM能较好地抑制GSK-3β的切割现象，caspase抑制剂Z-VAD有效地抑制了caspase-3的激活但却不能抑制GSK-3β的切割。结果提示，calpain介导小脑颗粒神经元凋亡时GSK-3β的切割。 3.GSK-3β的N-末端和C-末端都被calpain切割。 为了阐明GSK-3β的切割产物对凋亡可能产生的作用，我们首先观察GSK-3β的切割发生在哪一端。小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别给予25K、5K、5K+25μMALLM(calpain抑制剂)处理16小时后，收集细胞总蛋白，在8％的SDS-PAGE凝胶内进行分离；分别使用识别GSK-3β中间区域(345—420 aa)、C-末端的抗体(403—420aa)的抗体进行Western Blot检验。我们可以观察到识别GSK-313中间区域的抗体可以识别到3种切割产物(tGSK-3β 1,2，3)，而识别GSK-3β C-末端的抗体只能识别到一种切割产物(tGSK-3β 1)。以上结果表明小脑颗粒神经元凋亡时GSK-3p的切割产物中既有缺少N-末端的GSK-3β(简称为△N-GSK-3p)，也有缺少C-末端的GSK-3β(简称△C—GSK-3β)，还可能有N-末端和C-末端都被切割的GSK-313(简称为△N/C—GSK-3β)，说明GSK-3β的N-末端和C-末端都被calpain所切割。此外，我们还分别对重组纯蛋白His—GSK-3β和免疫沉淀293细胞内过表达的GSK-3β-V5产物进行体外calpain酶切实验。酶切结果和神经元内现象一致，结果表明calpain可以直接切割GSK-3β,切割位点既发生在N-末端，也发生在C-末端。 结论： 1、GSK-3β为撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡所必需； 2、Calpain介导了GSK-3β的切割； 3、GSK-3β的N-末端和C-末端都被calpain切割。