【摘 要】
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目的:通过制备壳聚糖（Chitosan,CS）纳米粒子模拟中药汤剂中的多糖微粒体系,以Caco-2细胞模型研究不同粒径纳米粒子对小檗碱（Berberine,Ber）经Caco-2细胞摄取/转运的影响及相关机制。方法:（1）以水溶性CS为原料,采用离子凝胶法制备不同粒径的CS纳米粒子,使用激光散射粒度仪检测粒子粒径与电位,使用扫描电子显微镜观察粒子形貌;（2）以Transwell建立Caco-2细胞
【基金项目】
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国家自然科学基金（81303239）项目:中药汤剂微粒体系对有效成分吸收的影响及机制研究；
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目的:通过制备壳聚糖（Chitosan,CS）纳米粒子模拟中药汤剂中的多糖微粒体系,以Caco-2细胞模型研究不同粒径纳米粒子对小檗碱（Berberine,Ber）经Caco-2细胞摄取/转运的影响及相关机制。方法:（1）以水溶性CS为原料,采用离子凝胶法制备不同粒径的CS纳米粒子,使用激光散射粒度仪检测粒子粒径与电位,使用扫描电子显微镜观察粒子形貌;（2）以Transwell建立Caco-2细胞单层膜实验模型,采用扫描电镜、跨细胞膜电阻、荧光素和盐酸普萘洛尔通过率等指标检测细胞单层膜的完整性与紧密性;（3）以噻唑蓝法确定CS纳米粒和Ber的细胞相容性/毒性;通过高效液相色谱法、BCA蛋白定量法等实验手段考察CS纳米粒粒径特征对Ber细胞摄取量的影响;研究CS纳米粒子对Caco-2细胞模型AP→BL及BL→AP双向转运Ber的影响;（4）分别通过改变温度和加入能量抑制剂叠氮化钠（Sodium Azide,Na N3）、网格蛋白介导的内吞抑制剂氯丙嗪（Chlorpromazine,CPZ）、小窝蛋白/脂筏结构介导的内吞抑制剂甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin,MβCD）、巨胞饮途径抑制剂盐酸阿米洛利（Amiloride HCl Dihydrate,EIPA）和肌动蛋白微丝抑制剂细胞松弛素D（Cytochalasin-D,CD）,考察纳米粒子影响Caco-2细胞摄取Ber的机制。结果:（1）CS纳米粒子粒径均一,分别为P1（450±34）、P2（318±14）、P3（670±57）nm,电位为P1（20.2±1.6）、P2（17.1±0.4）、P3（12.8±1.0）m V。（2）Caco-2细胞单层膜实验模型在电镜下可清晰观察到微绒毛和紧密连接;跨膜电阻值为（387±13）Ω·cm2;荧光素表观渗透系数(Apparent Permeability Coefficients,Papp)为（8.09±2.23）×10-7cm/s;盐酸普萘洛尔Papp为（7.06±0.80）×10-6cm/s。（3）CS纳米粒和Ber浓度分别为15μg/m L和10μg/m L作用细胞4 h,存活率分别为88%和78%;P1、P2、P3粒子组与对照组Ber的细胞摄取量分别为（0.9259±0.0648）、（0.6441±0.0029）、（0.7764±0.0980）、（0.4654±0.0782）mg Ber/g protein（mg/g）,选择CS粒子P1进行后续研究;在转运实验中,CS粒子组Papp（AP→BL）和Papp（BL→AP）分别为4.16×10-6cm/s和1.48×10-6cm/s,对照组Papp（AP→BL）和Papp（BL→AP）分别为0.55×10-6cm/s和1.48×10-6cm/s。（4）在4℃和37℃温度下,CS粒子组Ber的细胞摄取量分别为（0.2863±0.0274）和（0.9259±0.1199）mg/g;Na N3、CPZ、MβCD、EIPA、CD组与对照组Ber的的细胞摄取量分别为（0.5539±0.0009）、（0.5167±0.0062）、（0.6033±0.0537）、（0.8848±0.0500）、（0.8385±0.0500）,（0.9259±0.1199）mg/g。结论:CS可显著促进Ber的Caco-2细胞摄取,粒径为（450±34）nm的CS纳米粒子具有最显著的促细胞摄取Ber作用;CS纳米粒子有利于Ber在细胞模型AP→BL的转运;低温与能量抑制情况下,纳米粒子不促进Ber的细胞摄取;同时,纳米粒子影响细胞摄取Ber还通过小窝蛋白介导的内吞与巨胞饮过程。因此纳米粒子影响Caco-2细胞摄取药物是多种途径联合作用的结果。
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